文档介绍：基因构建与表达实验报告
实验一目的基因扩增与纯化回收
一、聚合酶链式反应
实验目的:通过PCR反应将目的片段扩增出来,获得足量的目的片段。
实验原理:DNA双螺旋在90-95℃解链形成单链;50-55℃引物与单链结合;70-72℃TaqDNA聚合酶从结合在模板上的引物出发,以dNTP为原料,按碱基配对方式,从5’—3’方向合成新的DNA链。经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2的n次方倍。
实验仪器和材料:PCR仪 PCR管移液器 tip枪头
实验试剂:
双蒸水(ddH2O)
10×PCR缓冲液(含Mg2+)
4种10×dNTP 混合
Taq酶(Easy Taq)
DNA模板
两种引物(上游和下游)
实验步骤:
配制PCR反应体系
试剂
ddH2O
Easy Taq Buffer
dNTP
Easy Taq酶
甘油
上游引物
下游引物
DNA模板
100ul大体系
65
10
10
10
2
2
2
注:一般情况下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、Easy Taq酶、甘油配体系分装到PCR管中(100ul/管),再加入对应的上下游引物和模板
放入PCR仪,按照实验设计的温度进行PCR,反应参数如下:
(1) 94℃预变性4min;
(2) 94℃变性1min;
(3) 55℃;
(4) 72 ℃延伸2min;
(5) 重复(2)-(4)30个循环;
(6)72 ℃终延伸10min;
二、琼脂糖凝胶电泳检测
实验目的:通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量的大小,检测目的基因片段是否扩增出来。
实验原理:DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA在碱性溶液中带有负电荷,在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时,由于琼脂糖凝胶具有一定孔径,长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一,迁移的速度不同,从而可以按照分子量大小得到有效分离。溴化乙锭(EB)可插入到DNA分子的相邻碱基之间,在紫外光的照射下出现荧光,从而指示DNA含量和位置。
实验仪器:电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液枪、一次性手套
实验试剂: TAE 、EB溶液、凝胶加样缓冲液、琼脂糖
实验步骤:
1%琼脂糖凝胶的制备(以制备5块胶为例):
(1),加入160ml 1 x TAE缓冲液,在微波炉上加热溶解煮沸熔化,取出摇匀至无沉淀。
(2)取有机玻璃内槽,放置于水平位置,用移液枪吸取少量胶将有机玻璃内槽两端密封。冷却到60℃左右(手感温度不烫手即可)加入7ulEB溶液,摇匀后倒入有机玻璃内槽,等距插入5个样品梳子。
(3)冷凝后将梳子拨出,电泳胶放入电泳槽中,加入TAE电泳缓冲液没过胶面。
2、加样
用移液枪取缓冲液,依次点3ul缓冲液在点样板上,再取PCR样品溶液10ul左右与缓冲液混匀后,加入样品孔中,并记录好点样顺序。(大体系PCR产物需要回收,点样时更换枪头避免交叉污染)
3、电泳及结果观察
接通电泳槽与电泳仪的电源,170V恒压电泳20min,电泳至溴酚蓝接近胶底部边缘即可;电泳完毕,取出凝胶,放在紫外灯下观察DNA条带的位置,根据DNA条带与溴酚蓝的相对位置估算DNA分子量大小,记录结果。
三、DN***段回收:
1、摇匀GS树脂,,将PCR大体系产物加入到GS树脂中,用移液枪吹打混匀,静置10min,让片段结合到GS树脂上
2、将混合液转入纯化柱中,13000rpm瞬时离心,弃收集管中液体
3、加600ul80%异丙醇洗脱两次,13000rpm瞬时离心,弃收集管中液体,13000rpm空甩20min ;,放入30-40摄氏度烘箱烘干10min左右,使异丙醇完全挥发。
4、取出加入50ul ddH2O浸润树脂干粉,静置10min让ddH2O充分浸润树脂干粉, 13000rpm离心2-3min,得到的PCR产物用于双酶切。
实验结果:
序号
引物号
100ul大体系
20ul小体系
片段大小
1
P18279
√
327
2
P18280
√
339
3
P18281
√
378
4
P18282
√
321
5
P18283
√
552
6
P18284
√
231
7
P18285
√
222
8
P18286
×
√
327
9
P18287
√
501
10
P18288
×
×
528
11
P18290
√
471
12