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农杆菌感受态细胞的制备.pdf

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农杆菌感受态细胞的制备.pdf

文档介绍

文档介绍:实验一 农杆菌感受态细胞的制备
[目的及要求]
了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
[实验原理]
在利用根癌农杆菌介导的基因转化中,首先要获得含有目的基因的农杆菌工
程菌株。
在基因工
二、试剂:液氮
YEB 液体培养基(1L):酵母提取物 1g,牛肉膏 5g,蛋白胨 5g,蔗糖 5g,
MgSO •7H O ,,高压灭菌。
4 2
YEB 固体培养基:每升 YEB 液体培养基加 15g 琼脂粉,高压灭菌。
卡那霉素(Kan)储液:50mg/ml
利福平(Rif)储液:50mg/ml
YEB 固体培养基平板(Kan 抗性):灭菌后的 YEB 固体培养基待其温度降至
50℃时加入卡那霉素(Kan)和利福平(Rif),至终浓度分别为 100µg/ml和 50µg/ml,
混匀后立即倒入培养皿,凝固后4℃倒置保存。
[实验步骤]
1、在 200µl 感受态细胞中加入 2-6µl 质粒(pBI121)DNA,冰浴 5min,液
氮中速冻 5min;
2、迅速转入 37℃水浴中,热激 5min;
3、加入 1ml YEB 液体培养基, 28℃慢速振荡培养 2-4 小时;
4、3000rpm 离心 4min,去一部分上清,留取 200µl 菌液涂布于含有 50µg/ml
Kan 和 50µg/ml Rif 的 YEB 平板;
5、放置约 ,待水份干后, 28℃培养约 24 小时至长出菌落。
实验三 农杆菌转化子的鉴定
[目的及要求]
掌握农杆菌质粒 DNA 的提取方法。将从农杆菌提取的质粒与对照质粒同时电
泳,通过比较确定获得了农杆菌转化子。
[实验原理]经改造的 Ti 质粒(只含有帮助 T-DNA 跳到植物染色体上的 Vir 区)存在于
农杆菌工程菌株中,含有 T-DNA 的双元载体(Binory Vectors)完成重组后可以
在大肠杆菌中扩增,再转入农杆菌中。从抗性培养基上筛选得到的农杆菌转化子
中应携带转入的重组质粒,而对照菌株则没有。
碱裂解法是一种应用最为广泛的质粒 DNA 提取方法,该法用于从小量培养物
中抽提质粒 DNA,比较方便、省时,提取的 DNA 质量较高,可用于 DNA 的酶切、
PCR 甚至测序。提取质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异
而使其分离。当细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时,在 pH 高达 的碱性

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