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文档介绍:重组子的筛选
生物与食品工程学院
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重组子的筛选
并非所有的受体细胞都能导入重组子DNA分子,导入外源DNA分子的受体细胞不一定能良好增殖。为了从众多的受体细胞中筛选出含有外源重组DNA的克隆子,必需利用载体、宿主细胞重组子的筛选
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重组子的筛选
并非所有的受体细胞都能导入重组子DNA分子,导入外源DNA分子的受体细胞不一定能良好增殖。为了从众多的受体细胞中筛选出含有外源重组DNA的克隆子,必需利用载体、宿主细胞的特性对受体细胞进行筛选或选择。
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重组子的筛选
导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
如果重组子中含有目的基因,称为阳性克隆子,或期望重组子。
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重组子的筛选
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重组子的筛选
将转化处理后的受体细胞接种在选择培养基上,培养一定时间,根据菌落生长情况挑选转化子。
在普通培养基中加入适量的某种选择物,即为选择培养基。
选择物由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定,如:抗生素、显色剂。
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重组子的筛选
筛选方法主要包括:
1. 抗药性筛选
2. 显色筛选
3. 依据重组子结构特征筛选
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抗药性筛选
利用载体上的抗药性选择标记进行筛选。
氨苄青霉素(Ap或Amp),bla基因可以编码β丙酰***酶,可降解Ap
***霉素(Cm或Cmp),cat基因编码***霉素乙酰转酰基酶,使Cm乙酰化而失效
卡那霉素(Km或Kan),Km抗性基因可以转译一种能修饰Km的酶,阻断Km对核糖体的干扰。
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抗药性筛选
四环素(Tc或Tet),Tc抗性基因转译一种能改变细菌膜的蛋白,防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。
链霉素(Sm或Str),Sm抗性基因转译一种能修饰Sm的酶,抑制Sm与核糖体结合。
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抗药性筛选
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA转化子的筛选。
正向选择
插入失活则成为负向选择

培养时间不宜过长,12~16h,转化子菌落会降解药物,导致周围药物浓度降低,长出假转化子菌落。
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抗药性筛选
插入失活
外源目的基因插入载体后,抑制筛选标记基因的表达。
插入表达
外源目的基因插入载体后,激活筛选标记基因的表达。
在筛选标记基因前连上一段负调控序列。
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显色筛选
原理:如果在载体DNA上组入LacZ’,则重组DNA分子会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到蓝色的转化子菌落。

由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长的时间,因此观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。
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营养缺陷型筛选
一些参与核苷酸代谢的基因

酵母载体选择标记基因

培养基
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依据重组子结构特征进行筛选
凝胶电泳分析:在转化子筛选的基础上,依据有外源DN***段的重组质粒与载体DNA之间的大小差别来区分重组子和非重组子。
1. 在平板上挑选菌落
2. 将菌落放入细菌裂解液,悬浮-离心-取上清
3. 电泳
优点:直观、快捷、尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。
缺点:载体可能会与一个以上的外源DN***段连接
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依据重组子结构特征进行筛选
限制性核酸内切酶酶切分析:从转化菌落中挑选菌落,提取质粒,用限制性核酸内切酶进行酶切,然后通过凝胶电泳分析。


优点:可以判断DNA分子插入的方向及分子量的大小。
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利用PCR方法筛选重组子
外源DNA两侧序列多数是已知的
通过两侧序列设计引物,扩增
电泳
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噬菌斑筛选
对于λDNA系统而言,转导受体菌后,转化子被裂解成噬菌斑,而非转化子则能正常生长,两者很容易区分。

1. 重组λDNA必须在野生型λDNA长度的78~105%范围内才能成功包装。
2. 空载λDNA也能正确包装,可以通过筛选标记基因进行筛选。
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筛选植物转化细胞
在植物转基因研究中,载体携带的选择标记基因经常称为“报告基因”,在有选择压力的情况下,可利用报告基因在受体细胞内的表达筛选转化细胞。
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筛选植物转化细胞
荧光素酶基因(LUC): LUC是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物,能够催化生物发光反应。
荧光素酶可以在植物细胞内正常表达
优点:检测迅速、灵敏度高、无污染,是一种理想的报告基因。
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筛选植物转化细胞
抗除草剂基因 (bar):bar基因编码的酶能够解除非选择性除草剂的毒性
除草剂是一种谷氨酸类似物,强烈抑制谷***酰***合成酶,从而导致植物体内氨的积累,并使植物死亡
bar基因可以将除草剂乙酰化,从而使植物具有除草剂的抗性。
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筛选植物转化细胞
葡萄糖酸苷

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上传人:相惜 8/8/2022 文件大小:78 KB

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