文档介绍：生物技术制药第七章酶工程制药
第三节 酶和细胞的固定化
酶反应几乎都在水溶液中进行，属均相反应，自然简便，但缺点是游离酶只能一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量；另外溶液酶很不稳定，容易变性和结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的底物专一性等性质也会发生变化。但是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。
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（2）交联法
交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法有可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法4种。其内容有酶分子交联、分子间交联或辅助蛋白与酶分子间交联；也可以先将酶或细胞吸附于载体表面而后再交联或者在酶与载体之间进行交联。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。参与交联反应的酶蛋白的功能团有N-末端的- 氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基及组氨酸的咪唑基等。
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交联法的优缺点
交联法的反应条件比较强烈，固定化酶的酶活回收一般较低，但是尽可能降低交联剂的浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。
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最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联，其方式如下：
—CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-
交联方式
N
CH
(CH2)3
CH
N
N
CH
(CH2)3
CH
N
—CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-
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交联法
一般用交联法所得到的固定化酶颗粒小，结构性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶（蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；或先用尼龙（聚酰胺类）膜或活性炭、Fe2O3等吸附后，再交联。由于酶的功能团，如氨基、酚基、羧基、巯基等参与了反应，会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性下降。为了避免和减少这种影响，常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。
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(3)包埋法
包埋法分为网格型和微囊型两种。
将酶或细胞包埋在高分子凝胶网络中的称为网格型；将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。
包埋法注意事项：防止高分子聚合造成酶的失活，只适于小分子底物和产物。
网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的方法。
由包埋法制得的微囊型固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高
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（4）选择性热变性法
专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变形而使酶固定于细胞内的方法。
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4、酶和细胞的固定化载体
在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物为载体或基质。固定化载体必须符合一定的条件：①固定化过程不引起酶变性；②对酸碱有一定的耐受性；③有一定的机械强度；④有一定的饿亲水性及良好的稳定性；⑤有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；⑥共价结合时具有可活化基团；⑦有耐受酶和微生物细胞的能力；⑧廉价易得。
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吸附载体，主要有物理吸附和离子吸附两种，物理吸附有无机物和有机物。
包埋载体，目前工业上用的包埋载体主要有卡拉胶、海藻胶等。
共价结合载体，有纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。
交联法是通过双或多功能试剂进行固定化，因此不需要固定化载体。也可用与吸附法和包埋法相同的载体进行交联。
酶和细胞固定化的载体见书中表7-1
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5、固定化酶的制备技术
（1）吸附法制备固定化酶技术
（2）包埋法制备固定化酶技术
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（1）吸附法制备固定化酶技术
物理吸附——用酶的水溶液与对此酶具有高度吸附能力的载体混合——洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶（易脱落，故不常用）
离子交换吸附——处理方法与物理吸附相同，但离子间力强（较常用）