文档介绍：核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳
目录
核酸
组成
理化性质
核酸分离、纯化的原则
核酸提取的基本步骤
材料准备
细胞裂解
分离、纯化
沉淀溶解
DNA提取的常用方法
R下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
上清液中的DNA用酚/***仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
组份
Tris-HCl （）
EDTA （）
NaCl
SDS
终浓度
100mM
20 mM
2%(W/V)
SDS提取缓冲液的配方
Tris-HCl （）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；
SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；
吸附材料结合法：
根据核酸分离纯化方式的不同有：
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。
快捷高效。
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。
其他方法
硅质材料
阴离子交换树脂
磁珠
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
阴离子交换树脂
磁珠
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
阴离子交换树脂
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。
磁珠
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
阴离子交换树脂
磁珠
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。
快捷高效。
硅质材料
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
阴离子交换树脂
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。
快捷高效。
硅质材料
阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
阴离子交换树脂
阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
阴离子交换树脂
磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。
磁珠
Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫***酸胍，酚等物质，异硫***酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。
核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。
异硫***酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。
TRIZOL法提RNA
目前有不少商业化的核酸抽提试剂盒可供选用，具体操作步骤参考各种产品说明书。
问题一：DNA降解
材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老
提取操作过于剧烈，DNA被打断
外源核酸酶污染
低温保存，避免反复冻融
液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液
增加裂解液中螯合剂的含量
细胞裂解后操作应尽量轻柔
试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌
DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融
核酸提取常见的问题
问题二： DNA样品不纯
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质
DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应
DNA中残留有金属离子
重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质
重新沉淀DNA，让酒精充分挥发
增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）
实验材料不佳或量少
破壁或裂解不充分
沉淀不完全
洗涤时DNA丢失
尽量选用新鲜（幼嫩）的材料
动植物要匀浆研磨充分，裂解时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）
低温沉淀，延长沉淀时间
加辅助物，促进沉淀
洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒
问题三：DNA提取量少
RNA提取常见问题一：样品不纯
蛋白
多糖多酚
DNA
离子
保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心
增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化
加入不含RNase的DNase处理
增加洗涤次数
RNA提取常见问题二：得率低
样品太多或太少
RNA在柱子上未洗出
洗出液中有酒精
减少或增加样品使用量
加入RNaseFree,放置几分钟再离心
漂洗后再次离心
RNA提取常见问题三：降解
样品不新鲜或保存不当
RNase污染
RNA溶液储存不当
取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存
研磨样品及时补充液氮
严格处理相应的器具和试剂
-70℃ 冻存，分装使用
为了检测提取核酸的浓度和内参，需要继续做琼脂糖凝胶电泳实验
实验原理
（1）DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。
（2