文档介绍：双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min,马上置于冰上冷却，再
力口入buffer和ligase。
就上面的对照简要说一下我的结果。转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆,约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。下面简要的说一下对照的结果。
A只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切
B约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%
C长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。
D长了很多克隆，证明感受态没有问题。
这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。
JM108感受态细胞的制备
刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。后来干脆自己做，感觉质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。
前期工作
分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓'磨刀不误砍材功'。注意事项
1■不要用经过多次转接或储于41的培养菌，最好从一70°C或-20°C甘油保存的菌种划板
（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划S行。同时记得设立对照：A、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，实验室很多材料从
师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP阴性空白培基。系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑克隆。
质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50“1的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全量加到200微升的感受态里，约为150ng（，）。效果也好。
试剂的质量：所用的试剂，如CaCI2等均需是最咼纯度的（.）,并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的，好像是陇西化学制剂,分析纯。
防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管,tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
培养基的配制
-AMP抗性培养基LB液体培养基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，***化钠IOg,加去离子水800ml充分搅拌溶解，用1mol/,补加去离子水至1000毫升，高压灭菌，4度保存。我一般没有用1mol/。而是直接精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，***化钠l0g加去离子水至1000ml。
LB固体培养基：%琼脂粉，高压灭菌消毒；
Amp母液：用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100ug/ul溶液，置-20°C保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5支分装（浓度100mg/ml即100ug/ul）。
含Amp的LB固体培养基:将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60C左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半量则最终浓度为50ug/ml
有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通培基，效果也很好。
:我们实验室只有CaCI2-6H2O，分子量219，配制100ml的，=。其实***-。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml，高压灭菌。
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