文档介绍：工程大肠杆菌高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的研究
摘要:细胞色素P450单加氧酶(P450BM3)能特异性催化脂肪酸ω碳位羟基化反应生成羟基脂肪酸,在前期构建携带单加氧酶基因P450BM3工程大肠杆菌(Escherichia有脂肪酸羟化酶基因P450BM3,菌株WX2、WX3为fadD基因敲除型,质粒pET-28a(+)携带fadL基因。本研究所用菌株、质粒及引物见表1。
试剂与培养基 Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP、感受态细胞,Takara公司;限制性内切酶及胶回收试剂盒,质粒提取试剂盒等,生工生物工程(上海)股份有限公司;十二酸(月桂酸)、10-羟基癸酸、卡那霉素、***霉素、胰蛋白胨、酵母提取物及IPTG等,中国医药集团有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
LB液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,pH 。
M9发酵培养基(g/L):葡萄糖20,磷酸氢二钠6,磷酸二氢钾3,***化铵1,***,。
仪器与设备 Aglient 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪,Aglient Technologies公司;LDZM-80KCS型蒸气灭菌器,驰通仪器(上海)有限公司;ZHWY-1102B恒温摇床,上海申安医疗器械厂;Neofuge15R型冷冻离心机,力新仪器(上海)有限公司。 方法
发酵条件 构建的工程菌株以1∶100的比例转接至500 mL M9培养基摇瓶中,菌株WX1和WX2培养时加入终浓度34 mg/L***霉素,菌株WX3添加终浓度34 mg/L***霉素和50 mg/L卡那霉素。恒温摇床振荡培养至菌体OD600 ,加入IPTG( mmol/L)诱导基因表达,为增加蛋白表达活性,培养温度降为30 ℃,以利于蛋白表达[13]。在菌体培养至指数后期, mol/L磷酸钾缓冲液(pH )配成菌悬液,添加葡萄糖(%)和脂肪酸进行全细胞催化反应。
代谢产物处理与分析 产物处理及检测参考文献[14],离心收集发酵液上清,6 mol/,利用等体积***仿抽提,抽提液加入甲酯化试剂(H2SO4/CH3OH)于60 ℃水浴酯化反应20 min后,等体积正己烷萃取。利用Aglient 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪对产物进行定量和定性,以10-羟基癸酸为内标进行定量。
转化率=ω-羟基脂肪酸产量/外源脂肪酸添加量×100%
代谢产物分析色谱条件为HP-5毛细管柱(30 m× mm× μm);升温程序为起始80 ℃,持续2 min,5 ℃/min升温至250 ℃,保持10 min。加样器和检测器温度分别为250 ℃和300 ℃。
质谱条件为电子轰击(EI)离子源,离子能量70 eV,离子源温度220 ℃;扫描模式为全扫描;质量扫描范围m/z为10~600。
2 结果与分析
fadD基因缺失对羟基脂肪酸产量的影响
大肠杆菌脂肪酸β氧化途径过程会消耗脂肪酸[15],因此在羟基脂肪酸的合成途径中敲除脂酰基辅酶