PCR扩增产物的分析.ppt

文档介绍：工作总结 /述职报告/季度汇报 /演讲报告
PCR扩增产物的分析
2018. 06. 02
PCR扩增产物的电泳分析
琼脂糖凝胶电泳
常用于临床检测（定性）
聚丙烯酰***凝胶电泳
分离效果比琼脂糖好，条带比较集中
可用于科研及检测30%丙烯酰***
丙烯酰***，29克
N，N‘一亚***双丙烯酰***，1克
H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4℃可保存二个月
材料
10%过硫酸铵
过硫酰铵，1克，加水至 10 ml4℃可保存一周，-20℃可保存一个月
1×TBE电泳缓冲液
TEMED（四***乙烯基二***）
聚丙烯酰***凝胶的制备与电泳
配胶：根据分离DN***段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰***凝胶
按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰***液漏出
将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角
按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数
加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止
聚丙烯酰***凝胶的制备与电泳
立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会
室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，×TBE缓冲液
聚丙烯酰***凝胶的制备与电泳
小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰***会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则
将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡
聚丙烯酰***凝胶的制备与电泳
接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳
电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，，15～30min后取出水洗，紫外仪下观察结果
聚丙烯酰***凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银染）
电泳结果分析
DNA Marker
λ DNA
人工片段
100 bp ladder
酶切分析
根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切
酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段
此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究
分子杂交
检测PCR产物特异性的有力证据
检测PCR 产物碱基突变的有效方法
主要的杂交
Southern印迹杂交
斑点杂交
Southern印迹杂交：
在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记（探针）
与 PCR 产物杂交
此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测 PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交：
将PCR 产物点在***纤维素膜或尼龙膜薄膜上
寡核苷酸探针杂交
观察有无着色斑点
主要用于 PCR产物特异性鉴定及变异分析
RDB检测 -地中海贫血突变基因
-29（AG）
-28（ AG）
17（ AT，AAG  TAG）
βE （CD26 GAG  AAG）
IVS-I-1（ GT ）
IVS-I-5（ GC）
27-28（+C）
41-42（-CTTT）
43（ GT ）
71-72（+A或+T）
654（ CT）
微孔板夹心杂交法
通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异性杂交，使PCR产物间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果
该法使用了两个杂交过程来检测一个产物，其特异性较一次杂交的检测法高
Principle
：NOS（1×1014/cm2）
N-羟化琥珀酰亚***酯
Principle
--CCCCCC
Capture Probe:
：NH2
Detection Probe:
：Biotin
Principle
：NH2标记的探针
：Biotin标记的探针
Avidin-HRP 显色系统
：NOS基团
Principle
微孔板夹心杂交法 ——方法学评价
敏感度：该法检测HBV，敏感度达5个HBV DNA分子
敏感性和特异性与 PCR 32P 探针的Southern杂交法相当
PCR微孔板夹心杂交法：操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA
微孔板直接杂交
不是采用夹心法，而是直接将特异的探针固定于微孔