文档介绍：高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价
请在实验前预习《基础分析化学实验(第二版)》137-140页。
【目的】
了解高效液相色谱仪的工作原理;
学习评价液相色谱反相柱的方法。
【原理】
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。它采用高压输液泵和小颗粒的填料,与经典的液相色谱相比,具有很高的柱效和分离能力。色谱柱是色谱仪的心脏,也是需要经常更换和选用的部件,因此,评价色谱柱是十分重要的。而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。
评价色谱柱的性能参数主要有:
柱效(理论塔板数)n
式中tr为测试物的保留时间,W1/2为色谱峰的半峰宽。
容量因子k’
式中t0为死时间,通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。
相对保留值(选择因子)α
式中k1’和k2’分别为相邻两峰的容量因子,而且规定峰1的保留时间小于峰2的。
分离度Rs
式中tr1、tr2分别为相邻两峰的保留时间,Wb1、Wb2分别为两峰的底宽。对于高斯峰来讲,Wb=。
为达到好的分离,我们希望n、α和Rs值尽可能大。一般的分离(如α=,Rs=),需n达到2000。柱压一般为104 kPa 或更小一些。本实验采用多核芳烃作测试物,尿嘧啶为死时间标记物,评价反相色谱柱。
【仪器和试剂】
Waters 510高效液相色谱仪(由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i进样器,440检测器和记录仪组成)
色谱柱:5 cm× mm ., YWG-C18H37 (ODS),10 μm
流动相:甲醇-水(80+20)
样品I: 含尿嘧啶( mg·mL-1)、萘( mg·mL-1)、联苯( mg·mL-1)、菲( mg·mL-1)的甲醇混合溶液;
样品I I:尿嘧啶的甲醇溶液;萘的甲醇溶液;联苯的甲醇溶液;菲的甲醇溶液。·mL-1;
【实验内容】
准备流动相。将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL溶液,混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中。
检查电路连接和液路连接正确以后,接通高压泵、检测器和记录仪的电源。设定操作条件为: mL·min-1,压力上限2´104 kPa (约3000 psi),检测波长254 nm(该仪器检测波长已固定), AUFS, cm·min-1,记录灵敏度为5 mV。开启记录仪走纸开关记录基线。并调节基线到合适位置(一般为距右10%处)。
待基线平稳后(建议观察检测器的读数显示),将进样阀手柄拨到“Load”的位置,使用专用的液相色谱微量注射器取5μL样品注入色谱仪进样口,然后将手柄拨到“Inject”位置,同时按一下检测器的标记按钮,同时计时,记录色谱图。
重复(3)的实验两次。
用同样方法进纯样品的甲醇溶液,确定出峰顺序。
根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽,然后计算色谱柱参数n、k’,以及相邻两峰的α、Rs
将流速降为0,待压力降为0后关机。
思考题
高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点?
如何保护色谱柱延长使用寿命?
高效液相色谱实验II
固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量
【目的】