文档介绍：男性雄激素源性脱发患者毛囊干细胞增殖和凋亡的初步研究
董佳辉 万苗坚 冯智英 李英 李晓欣 龚子鉴 赖维 计斌 [摘要]目的:了解男性雄激素源性脱发(androgenetic alopecia,AGA)患者毛囊干细胞增殖和凋亡情stem cells; proliferation; apoptosis
AGA是一种常见的进行性脱发性疾病,不仅影响患者容貌,而且给患者心理和社交造成一定的影响[1]。目前,AGA发病的分子机理尚未完全阐明。
毛囊干细胞定居于毛囊外毛根鞘的隆突部位[2],除了维持毛囊生长周期循环,还可更新表皮和皮脂腺[3-4]。正常情况下,毛囊干细胞数量基本保持恒定[5],但在病理状态下,毛囊隆突部位微环境遭到破坏,毛囊干细胞数量和分裂增殖活性可能会发生改变而引起脱发,如红斑狼疮[6]和毛发扁平苔癣[7]。既往虽有对AGA患者毛囊细胞增殖和凋亡情况的研究报道,发现受累毛囊细胞有增殖活性的下降和凋亡的现象[8-9],但毛囊干细胞的增殖和凋亡情况不得而知。因此,本文通过研究AGA患者毛囊干细胞增殖和凋亡情况,初步了解毛囊干细胞在AGA患者中的受累状况,为进一步阐明AGA发病机制奠定基础。
1 资料和方法
临床资料
受试者纳入标准
AGA组:经临床确诊的男性AGA患者,年龄18~50岁,近3个月未系统使用抗雄激素药物和局部使用任何育发类产品或药物治疗,头皮正常完整,无细菌、真菌等感染性疾病及皮炎湿疹等炎症性皮肤病。
对照组:年龄在18~50岁,均为男性,本人及家族均无AGA病史;近3个月未系统使用性激素药物,头发生长正常,头皮正常完整,无细菌、真菌等感染性疾病及皮炎湿疹等炎症性皮肤病。
受试者排除标准:头部合并有其他皮肤疾病者;合并有其他严重的心肺肝肾疾病、精神病、糖尿病及自身免疫性疾病等者;其他原因引起的脱发者;不合作或资料不全者;未能签署知情同意书者。
受试者一般资料:AGA患者均为广州粤秀整形机构乐鬃毛发移植中心接受毛发移植的患者,共15例,均为男性,以Hamilton 分型为Va型,年龄23~48岁,±。3例正常头皮均选自中山大学附属第三医院颅脑手术患者,均为男性,±。该研究经中山大学附属第三医院伦理委员会通过,伦理批号:【2010】2-4号。
受试者取材部位选择及方法:AGA患者头皮分枕部非脱发区、脱发过渡区、脱发区三个区域,每个区域用同一钻孔刀(slot pouch ?3mm,Micro-Tools Europe,Germany)各取3块的头皮组织,每块大小约3mm×3mm×5mm。对照组取与脱发区相对应部位的头皮。并对取出的标本进行预处理,把头皮组织分离成只含1~2根毛发的小组织。
实验分组 分正常对照组、AGA枕部非脱发区组、AGA脱发过渡区组及AGA脱发区组。
实验方法
:CK15单克隆抗体(小鼠抗人,Santa Cruz,USA),PCNA多克隆抗体(兔抗人,Santa Cruz,USA),Texas Red荧光二抗 (山羊抗小鼠,Proteintech ,USA),FITC荧光二抗(山羊抗兔, Proteintech ,USA),TUNEL试剂盒(Sigma,USA);荧光显微镜(Olympus 81i,Japan)。
毛囊干细胞增殖活性和凋亡观察
毛囊干细胞的鉴定[10]:毛囊干细胞位于毛囊隆突部。本研究采用K15作为毛囊干细胞鉴定的标记物,如细胞浆染成红色即为毛囊干细胞。
毛囊干细胞增值活性观察:对预先处理的毛囊组织进行3μm连续切片,切片时以毛囊纵轴为方向。按照试剂盒操作说明对切片进行双重免疫荧光染色,对各组毛囊的CK15染色阳性的细胞中PCNA阳性细胞进行观察记数。
毛囊干细胞凋亡观察:操作方法同前。对对各组毛囊的CK15染色阳性的细胞中TUNEL阳性细胞进行观察记数。
:CK15免疫荧光阳性结果判定:细胞胞浆出现红色荧光。PCNA免疫荧光阳性结果判定:细胞胞核出现绿色荧光。TUNEL阳性结果判定:细胞胞核出现绿色荧光。每张切片用Olympus显微镜在图像分析系统下照相和计数,分别计算毛囊隆突部位CK15阳性细胞中PCNA阳性细胞的百分比和TUNEL阳性细胞数及总的阳性率。正常对照组和患者不同区域各观察5个毛囊