文档介绍：蛋白质的分离纯化 与定性定量分析
医学分子生物学
什么是蛋白质的分离纯化
分离:将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。
纯化:得到单一蛋白的纯品。
为什么要纯化蛋白质?
研究特定蛋白质的生物学功能(酶、生物活性蛋白,etc)
制备抗体
蛋白质晶体学研究
研究蛋白质-蛋白质相互作用
怎样纯化蛋白质?
生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差异,来分离或纯化它。
可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
可溶性:硫酸铵沉淀
等电点:离子交换层析
分子大小:凝胶过滤层析
生物学性质:亲和层析
蛋白质纯化的基本设计原则
原料应易得到,并尽可能富含目的蛋白;
应有特异性的蛋白质检测方法(最重要的因素,决定了纯化能否成功);
分级分离,先粗后细;
纯化条件尽量温和,避免蛋白失活。
蛋白质的检测方法
蛋白质的活性检测方法:必须快,必须是特异性的
蛋白质的免疫学检测方法:western-blot,前提是有特异的抗体
分离纯化的一般程序
前处理(取决于采用的材料)
动物材料处理:剔除结缔组织和脂肪组织
种子处理:去种皮,有机溶剂脱脂
动物细胞破碎:匀浆器、超声波处理
植物组织:研磨,纤维素酶
细菌破碎:超声波,溶菌酶
如果蛋白质定位于某一细胞器,可用差速离心法将其分离。
相对离心力/×g
时间/min
沉降的组分
1 000
5
真核细胞
4 000
10
叶绿体、细胞碎片、细胞核
15 000
20
线粒体、细菌
30 000
30
溶酶体、细菌细胞碎片
100 000
3~10 h
核糖体
粗分级分离(rough fractionation)
获得蛋白质提取液后,用一定方法,将蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
常用方法:盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等
特点:简便、处理量大、既能除去大量杂质(包括脱盐),又能浓缩蛋白质溶液。