文档介绍：生物化学与分子生物学实验原理（I）-蛋白质的分离纯化
高效液相-HPLC （High-Performance Liquid Chromatigraphy）
介质一般为在高压下稳定的衍生化硅胶，颗粒小（1-10 μity)
理想地状况: 1 k 5
如 k < 1, 洗脱太快以至于不能准确地确定 tR
k > 20意味着洗脱需要很长的时间.
目标: 分离度(Resolution)
Resolution (Rs) 定义为:
wb,1
wb,2
tR,2
tR,1
为了提高分辨率 Rs
加大保留时间的差别
减少峰宽
The resolution 分离度 R
分离度的表达式：
选择性因子a
a : Choosing a different type of molecular interaction by changing stationary phase
k : changing temperature or mobile phase
N : length of column
H : flow rate, particle size of packing,
viscosity of the phase
Optimum separation？
分子筛层析 凝胶过滤
（Molecular Sieve）
(GF) is a simple and reliable chromatographic method for separating molecules according to size
分子筛
Scanning electron micrograph of an agarose gel. Magnification x 50,000. Ref. Anders S. Medin,PhD Thesis, Uppsala University 1995.
分子筛又称为凝胶过滤（Gel Filtration， Gel Permeation ），体积排阻（ Size Exclusion ）
,亲水的,惰性的颗粒(Beads)组成.
The beads are composed of
dextran polymers (sephadex),
agarose(Sepharose瑞典，Bio-gelA美国，segavac英国)
polyacrylamide (Sephacryl or BioGel P) etc.
凝胶过滤色谱
基于大小不同的蛋白从限定大小颗粒内径的层析柱中进行洗脱体积(或流速一定时的洗脱时间)的差别
蛋白越小,在柱中的保留时间越长, 洗脱体积越大, 洗脱时间越长
对于蛋白的聚集敏感.
凝胶过滤色谱的原理
Gel Filtration Chromatography
进入胶颗粒中孔道的蛋白较之于被排阻在孔道之外的蛋白移动的较慢.
分离与蛋白的形状及大小有关
凝胶过滤色谱的基本术语
Vt = 总体积 (Total volume , the excluded volume plus the internal volume of the beads)
床体积: 膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积
The different volumes accessible to sample molecules
Vo = 外体积, 孔隙体积, 外水体积 (outer volume, the excluded volume surrounding the beads)
基质颗粒之间体积的总和
可用蓝色葡聚糖2000(2000Kd)测定.
the void volume----- all sample molecules have access to the liquid between the beads ------ ~30%
Vi = 内体积, 内水体积 (Intermediate volume , partially excluded)
the pore volume----pores allowing the sample molecules to penetrate into the gel filtration beads to di