文档介绍：薄荷组织培养条件的选择
马同富 蔡健 摘要:考察了消毒方式、外植体部位、培养基配方等因素对薄荷(Mentha haplocalyx Brip.)组织培养的影响。结果表明,外植体先用体积分数70%的乙醇处理30 s后,再用1 m***冲洗10 min,其中茎段需要用刷子刷洗几遍,然后用70%的乙醇(体积分数,下同)处理外植体30 s,再分别用1 mg/L HgCl2+2滴吐温80或40 mg/L的漂白粉对外植体消毒(表1)。消毒后均用无菌水冲洗4~5遍。
每次消毒40个外植体,分成2个瓶消毒,消毒后在超净台上剥去外叶后接种。对叶片进行消毒时,先消毒复叶,后切下小叶和叶柄,每次消毒2~3个复叶。 cm长的小段再进行消毒。各外植体接种后,每周观察外植体的形态变化,30 d后统计各消毒处理的污染率、死亡率、成活率。
污染率=污染的外植体个数/接种个数×100%;
死亡率=褐变死亡但没有被污染的外植体个数/外植体接种个数×100%;
成活率=成活且未被污染的外植体个数/外植体接种个数×100%
不同外植体对不定芽诱导的影响 分别以待萌发的饱满腋芽、茎段、顶芽为外植体,,将外植体接种在MS+ mg/L BA+ mg/L NAA+ mg/L GA3的培养基上。每种外植体每瓶接种3个,接种10瓶,重复2次。接种15 d后统计污染率、死亡率和成活率。
从芽的初发期至芽的生长期(2010年3~9月),每隔20 d采集茎段1次,茎段消毒后,接种在MS+ mg/L BA+NAA mg/L+ mg/L GA3培养基上,每次接种30个外植体,培养期间每周观察外植体的形态变化,接种30 d后统计不定芽的污染率、死亡率和成活率。
培养基组分对不定芽诱导的影响 ①基本培养基。分别以MS、1/2MS、B5为基本培养基, mg/L BA+ mg/L NAA+ mg/L GA3,%%的琼脂,~,于121 ℃高温高压灭菌20 min。在灭菌后的培养基中接入带1个芽的薄荷茎段光照培养,光照度为1 000 lx,光照时间为14 h/d,培养温度为25 ℃。每处理接种60个外植体,重复3次。②激素浓度。2010年8月采集薄荷叶片、叶柄、茎段,先用70%的乙醇消毒30 s,再用1 mg/L HgCl2+2滴吐温80消毒20 min后, cm长的小段, cm× cm的小块,接种到MS培养基中,培养基分别添加A. mg/L BA+ mg/L NAA;B. mg/L BA+ mg/L NAA;C. mg/L BA+ mg/L NAA;D. mg/L BA+ mg/L NAA。每处理10瓶,每瓶接种5个外植体,重复2次。培养期间每7 d观察记录外植体的形态变化,30 d后统计不定芽诱导率。
2 结果与分析
消毒方式对薄荷外植体组织培养的影响
表1显示的是以茎段和芽为外植体,消毒方式对组织培养效果的影响。可以看出,外植体的污染率随消毒时间的延长而降低。由于茎段表面密被星状毛,不利于灭菌,所以污染表现较早,一般在7~10 d左右。叶柄伤口处常有白色脓状分泌物流出,为细菌污染,少有真菌污染,这与叶腋处消毒不彻底有关。以比较幼嫩的组织为外植体,消毒时间对其死亡率的影响较大,因此在选择适宜的消毒时间时,除了考虑污染率外,还要参考死亡率。总的看来,各外植体用70%的乙醇处理30 s后用1 mg/L HgCl2+2滴吐温80浸泡消毒效果较好,适宜的消毒时间分别为:茎段、叶片、叶柄和已萌发的芽12 min;末萌发的芽10 min。
不同外植体的不定芽诱导效果
将消毒处理后的幼叶、叶柄接种在不同的培养基上,7 d后幼叶的主脉最先长出不定芽,继而切口处逐渐愈伤化,不定芽自两端形成,并向中间发展,直至整个组织;20 d后,不定芽已覆盖整个叶片;叶柄在接种15 d后,其一端开始出现黄绿色紧密的不定芽,有的叶柄两端出现不定芽,但其不定芽的增殖较慢。
顶芽、腋芽、茎段3种外植体不定芽的萌发生长情况见表2。由表2可知,就3种外植体的不定芽诱导时间而言,茎段所需时间最短,接种后7 d即可萌发;腋芽所需时间最长,为10 d。从诱导率来看,茎段的诱导率最高,为80%,顶芽的诱导率最低,仅为54%。从不定芽的生长情况来看,茎段不定芽