文档介绍：DNA的提取方法简介
从各种材料中提取DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物。如从病毒中提取DNA比较容易,多数病毒DNA分子量较小,提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量DNA的提取方法简介
从各种材料中提取DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物。如从病毒中提取DNA比较容易,多数病毒DNA分子量较小,提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大,一般达2×10道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA,除核DNA外,还有质粒DNA等。
1、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、***仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖,RNA及无机离子等,从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中,几乎不溶解,***化钠溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至1mol/L***化钠中的溶解度很大,比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,***化钠中溶解度较大。因此,在提取时,
常用此法分离这两种核蛋白。
细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方
法有三种:
①机械方法:超声波处理法、研磨法、
匀浆法;
②化学试剂法:用SDS处理细胞;
③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可
使细胞壁破碎。
由于高等动物DNA主要存在于细胞核与线粒体中,所以提取时有两个困难(高等植物与此类似):
①破碎细胞难;从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA可能会被DNase降解,而动物组织:特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器,易造成DNA断裂。
②分子量大,一般比细菌的大2—3个数量级,比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料,要根据具体情况选择适当的分离提取方法。
(1).浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M***纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的***仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及***仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.
,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按***仿---异醇法除去蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在***,,并称SSC溶液,提取DNA.
二苯***显色法测定DNA含量
强酸、加热条件下,可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂,而产生嘌呤碱基,脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―***基戊醛,此物与二苯***反应生成蓝色化合物,在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度,而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定,而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香,羟基醛都能与二苯***形成各种有色物质,干扰测定。
1、二苯***试剂:***(需在70%乙醇试剂中重结晶2次),溶于180ml冰乙酸中,再加入8ml过***酸(60%以上),混匀待用,%乙醛溶液,所配试剂应为无色。
每组需56ml
共需2800ml
2、DNA标准溶液:(须经定磷法确定其浓度)。
每组需12ml
共需600ml
3、%乙醛:取47%,加重蒸水定容至100ml(放于冰箱中,一周之内可以使用)。
共需70ml
4、(测样品液:准确称取猪脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克/毫升的溶液。
每组需4ml
共需200m