文档介绍：血清白蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定
目的要求
(一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。
(二)了解柱层析技术。
(一)分离纯化的意义
①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸,研究其结构与功能,对于了解生命活动的规律,阐明生命现象的本质有重大意义。
②工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业,需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。
③医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要
(二)分离纯化的要求
1、纯度:主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构,一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂,都要求均一;工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂,达到一定纯度即可,不要求均一。
2、活性:要求大分子保持天然构象状态,有高度的生物活性。
3、收率:希望收率越高越好,但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多,损失越大。
(三)分离纯化的一般程序
生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段:
①材料的选择和预处理
②破碎细胞及提取(有时还需要进行细胞器的分离)
③分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离
其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。
选择材料
破碎细胞
提取
分离纯化
分析及鉴定
常用的蛋白质分离纯化技术
溶解度
盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀
分子大小
透析、超过滤
密度梯度离心、凝胶过滤
带电特性
电泳、离子交换层析
吸附特性
吸附层析
对配体分子的亲和性
依据性质
方法
用于粗分
用于细分
亲和层析、金属螯合层析
一、盐析(中性盐沉淀)
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外,多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。
盐析法的优点:
①成本低,不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
盐析的基本原理
蛋白质水溶胶的稳定因素:水化膜和电荷。
中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。
破坏水化膜,暴露出疏水区域,
中和电荷,破坏亲水溶胶
溶解度
盐浓度
Salting-out
Salting-in
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
等点电时的蛋白质(亲水胶体)
带负电荷蛋白质(亲水胶体)
脱水
脱水
脱水
带负电荷蛋白质(疏水胶体)
不稳定蛋白颗粒
阴离子
阳离子
碱
酸
酸
蛋白质聚集沉淀
带正电荷蛋白质(亲水胶体)
碱
+
+
水化膜
带正电荷蛋白质(疏水胶体)