文档介绍：现象
原因
解决
反影(白色条带,黑色背景)
1 HRP过高(背景较高)
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1
显影后膜上条带处变为黄色
2 HRP过高(敏感性太高)
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2
信号弱或无
3 HRP过高引起底物迅速耗竭
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3
4 抗体-抗原系统敏感性过低
提高抗体浓度/蛋白上样量*注4
5 转膜不充分/过转
优化转膜条件*注5
6 HRP或底物活性降低
测试活性或选用敏感底物*注6
高背景
7 HRP过高(背景较高)
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7
8 封闭时间不足
延长封闭时间4度过夜最好*注8
9 抗体与封闭液有交叉
更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9
10 TBST洗脱不足
增加洗脱时间、次数、用量*注10
11 暴光时间过长
降低暴光时间*注11
12 抗原-抗体浓度过高
降低抗体浓度或蛋白上样量*注12
条带内无显影的白点
13 转膜不良(如有气泡在胶-膜之间)
精细操作*注13
14 膜平衡不均/油脂污染
按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14
15 膜与X光片间有气泡
显影前去除气泡*注15
非特异性条带
16 抗体交叉反应
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16
17 SDS非特异性结合蛋白条带
使用无SDS转膜液*注17
散在小圆斑
18 封闭液有杂质颗粒
静置牛奶使大颗粒沉淀,仅用上层*注18
*注1 其具体问题有二:一是背景较高,,则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决,要么动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在,只是一种现象,在压过的膜可以看出来(只在加底物后一段时间出现,几小时后可能还会消退,有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来,所以要把握时机)。如果没有达到原因1和原因3的程度,那么这种情况一定能够看到很强的荧光,是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大,所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压10s~30s,甚至可以3~5s,即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况,就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大(如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡,这样就不可取了,但依然是粗大的、非条带的本来面目),那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度(减少上样量很不稳定且能力有限,故很少使用)来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现,经常与下面的原因4、5、6混淆,特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下,来不及压片就已耗竭底物,往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定,也可以根据原因2的现象确定,以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。
*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述,只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法:对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量,而落实到每一个具体条带(同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳),。(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章),超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准,因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的