文档介绍：核酸类药物
第一节核酸类物质的分离提取及其发酵生产
一、RNA与DNA的提取与制备
(一) RNA的提取与制备
(1)RNA及其工业来源
从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。
通常在细菌中RNA占5%-25%,%~15%,%~28%, %~%。
培养酵母菌体收率高,易于提取RNA,在工业上主要由RNA生产5‘-核苷酸。
(2)高RNA含量酵母菌株的筛选
可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株,也可以用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。
糖蜜
水
糖蜜配料液
水解
水解液
中和
中和沉淀
过滤
清糖水
种子
揺瓶发酵
种子培养物
种子发酵
种子发酵培养物
连续发酵
发酵液
收集菌体
酵母菌体
酵母浆
保温抽提配料
抽提液
分离
抽提清液
酸化
酸化液
过滤
RNA
洗涤干燥
RNA干粉
磨粉包装
成品
水洗涤
发酵法生产高含量RNA酵母及其RNA提取工艺流程
(3)用工业废水培养高含量RNA酵母
减少环境污染,降低粮食消耗
(4)RNA的提取实例
啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。
取100g压榨啤酒酵母(含水70% ),加入230ml含NaOH 3g的水,20℃以下搅拌30min。用6mol/L HCl调至pH7,搅拌15分钟,离心得上清液255ml。冷至10℃以下,6mol/L ,置冷过夜,(纯度80%)。
(二) DNA的提取与制备
取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎2次成浆,加入等体积水,搅拌均匀,倾入反应锅内,缓慢搅拌,升温至100 ℃,保温15分钟,迅速冷却至20~25 ℃,离心去除鱼精蛋白等沉淀物,共获得35L含热变性DNA溶液。加乙醇沉淀,可得到固体DNA产品。
动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟,匀浆于2500rpm离心30分钟,沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次,每次洗涤后离心,将沉淀悬浮于20倍量的冷生理盐水中,再捣碎3分钟,加入2倍量5%十二烷基磺酸钠,并搅拌2~3小时,在0 ℃2500rpm离心,在上层液中加入等体积的冷乙醇,离心即可得纤维状DNA,再用冷乙醇和丙酮洗涤,减压低温干燥得粗品DNA。
二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸
(一)酶解法及碱水解法制备核苷酸
桔青霉或熄曲霉
液体培养2天
发酵液
压滤除菌体
酶液
酶解液
鱼精
绞肉机粉碎
鱼精匀浆
热变性冷却,过滤
DNA溶液
加热使酶失活,,过滤
DNA降解液
吸附于氯型阴离子交换树脂分步洗脱
脱氧胞苷酸
dCMP
脱氧腺苷
dAMP
脱氧胸苷酸
dTMP
脱氧鸟苷酸
dGMP
混合,调pH
保温
桔青霉M843培养
产生核酸酶P1
酵母提取
RNA
RNA降解成5‘-核苷酸
阳离子树脂分离
无离子水洗涤
UMP浑浊液
除盐等杂质UMP
UMP稀溶液
UMP干粉
GMP,CMP混和液
GMP浓溶液
GMP干粉
CMP稀溶液
GMP浓溶液
GMP干粉
AMP稀溶液
AMP浓溶液
AMP干粉
CMP溶液
~
~
~
碳柱吸附,解析
阴离子树脂
乙醇沉淀
阴离子树脂
阴离子树脂
乙醇沉淀
乙醇沉淀
乙醇沉淀
减压浓缩
(I+G)
呈味核苷酸
桔青霉M843培养
产生核酸酶P1
曲霉M1197培养
产生AMP脱氨霉
RNA降解,AMP脱氨
RNA溶解,调pH升温
阳树脂分离(I+G)
减压浓缩
乙醇结晶
干燥
产品(I+G)
谷氨酸发酵液
离心
湿菌体
自溶
pH10
菌体自溶液
除盐
无盐提取液
离心
清液
阴阳离子交换树脂
单核苷酸纯化液
浓缩
浓缩液
结晶
结晶单核苷酸