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学位论文作者。王玉格⋯学位论文作者:王玉梅日期:加//年多月占月学位论文使用授权声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。日期:本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。
调节细胞的黏附及迁移。研究发现多种实体瘤中存在有尸陋Ⅳ基因的突变、等位酶活性可以去掉,姿崃字<〈位上的磷酸基团,使其转化为二磷酸磷脂酰肌醇,从而调控细胞的增殖与凋亡。其蛋白磷酸酶活性可以抑制黏着斑激酶⑺苛言罨鞍准っ姿峄基因的缺失或低表达,急性白血病,泊嬖谟惺濉艋虿同程度的缺失、低表达、甲基化。但是基因及其蛋白的异常如何在的发生发展、血管新生及髓外浸润过程中发挥作用仍有待于进一步探讨。儿童是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。它是由于不成熟的淋巴系或髓系祖细胞在发育成熟过程中失去调控,从而呈克隆性扩张,使得细胞被阻滞于一定的分化期而发生的。的发病机制目憾嗳衔J腔肪骋蛩亍⒁糯因素以及癌基因和抑癌基因等多种致病因素综合作用的结果。近年来由于分子生物学技术的迅速发展,多种抑癌基因在发病中的作用越来越明确。在发病机制中的作用越来月受到重视。扇,际蹩筛咝А⑻匾斓叵碌髂勘昊虻谋达,是研究内源性基因功能和信号转导途径的强有力工具。但是在过程中
救援..赴P停ü訮删琓建立其阴性对照狦强Ⅳ甴建立其阴性对照甴瓽⑹",并检测相关信号通路分子表达情况。本实验旨在探讨艋第一部分基因扇偶捌銻仍《驹靥的构建与鉴定常有“脱靶效应”的发生,造成对试验结果的误判。为研究基因在儿童发病机制中的作用,本实验构建了基因的及其逃避策略结构琑救援的慢病毒载体质粒。应用人馨拖赴基因敲减..瑃基因的敲减及救援,观察人甃蠵鞍椎谋泶锛癆通路的活化情况、细胞增殖和细胞周期的变化。应用人主动脉内皮细胞永生化细胞救援甴畆细胞模型,观察人。迁移、的生物学特性,及其下游信号分子与儿童发生、发展的相关性。探讨所构建的及其救援慢病毒载体系统在基因操作中的功能,及避免过程中脱靶效应对实验结果造成误判的作用。实验目的:构建人尸死騌捌銻仍穆《驹靥宀⒔屑ǎD苡行的避免“脱靶效应”所引起的假阳性结果对实验的干扰、为研究户髓’Ⅳ基因功能提供稳定的转染载体。方法:菇ú呗陨杓撇⒑铣对己筛选确定的能表达濉艋騌姆⒓惺峁瑂牡チ垂押塑账幔屑涮韏环慷怨押塑账崃蕉朔直鸫忻盖形坏阋苑奖慊虿僮鳌该有效靶序列的特点是:含量在痮%,以碱基“笨J迹个碱基“.襕中文摘要
愧艋騃州慢病毒载体甎畇墓菇ㄍü个从步骤分别扩增出:含舳含赐口盖形坏的寡核苷酸片段、能入鐾宓阃槐洌诤塑账崴缴细谋浠颍渌泶锏腜烊坏鞍妆码不变,又使荒茏饔糜谡庵帧巴庠瓷杓频膍保佣市砭仍!巴源设计的”两端分别带有酶切位点以方便基因操作。把这个基因片段与ǜ婊蛉诤虾螅ㄏ蚩寺〉皆靥錺..质粒的疊酶切位点处,从而获得人基因的救援慢病毒载体甎畆0颜个载体引入实验中,如果能恢复由的变化,则可以排除因耐寻行вλ鸬募傺粜越峁佣苊舛曰因功能的误判。使錴Ⅳ基因沉默的含酶切位点癠畇之后把作为插入片段,亚克隆到载体瓽质粒的/酶切位点。经细菌转化,氨苄抗性筛选。阳性克隆提取质粒;酶切及前引物测序验证。在菘釨分析与其他基因的同源性。甈騌腞仍《驹靥錺..的构建通过鯬反应分别扩增出对应恢糜型逋槐含盖形坏大小为膍⒋笮∥珺酶切位点膍及含有鐾逋槐涞氖錡基因的全长片段。之后把与报告基因诤系腇寺〉皆靥錺畇柿5腅/盖形点。经细菌转化、氨苄抗性筛选。阳性克隆提取质粒;酶切及测序鉴定。并与菘庵械幕蚪斜冉稀《镜陌昂偷味炔舛赴岷隙却ナ保赥介导下,:合直鹩肼《局柿..,甎畆沧H
实验要求的澳康幕蚴緀ざ纫恢隆应用已成功构建的人硪騌《驹靥寮捌銻仍《驹靥成功构建出人尸陋Ⅳ基因及其慢病毒载体。,能够满足后期的体内外实验。第二部分基因敲减及救援后馨拖赴鲋澈托藕磐返谋浠色荧光。提示豶Ⅳ基因慢病毒载体甎畇捌銻仍细胞;转染后栈裆鲜种慢病毒贮液。用细胞,采用逐孔梯度稀释法~击舛ú《镜味取5怪糜ü庀晕⒕迪录觳釭表达量。畃和蚱卫┰霾锞璉%脂糖凝胶电泳,紫外线透射仪下观察,