文档介绍：《生物技术大实验》实验指导书
生物技术教学部
常平安舒坤贤谢永芳编
重庆邮电学院生物信息学院
2005年3月1日
前言
《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程,是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学,通过此实验课程,学生不仅学习到最基本的分子生物学技术,而且学习到前沿的生物技术。
分子生物学实验技术突飞猛进,日新月异。分子生物学技术的广泛应用,在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用,而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期,由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。
学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室,离不开实验课上的训练,很多理论上的原理都需要到实验课上去验证,很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。虽然目前的分子生物学实验教材版本众多,但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设,促进本学科实验课的开设,我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著,根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件,特选择了部分实验内容,并结合我们的经验与体会,汇编成了生物技术大实验实验指导书,以供参考。在使用过程中,可根据不同的层次适当增减。同时,对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等,限于我们目前的条件,只能作些演示或作为动态给以介绍,条件一经成熟,即行开设。
由于分子生物学技术和生物技术的快速发展,加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程,许多工作还处于不断探索的过程中,难免有不妥和疏漏之处,恳切期望读者提出宝贵意见,以利不断修正完善。
编者
2005年3月
目录
实验一质粒的提取和纯化……………………………………………. 3
实验二质粒DNA的电泳和纯度检测…………….……………………..6
实验三 PCR产物的TA克隆……………………………………………...9
实验四感受态大肠杆菌细胞的制备…………………………………...12
实验五重组DNA转化大肠杆菌…………………………………........12
实验六 PCR扩增基因特异片段………………………………………..15
实验七 DNA片段的回收及纯化………………………………………..19
实验八 PCR法快速鉴定重组载体……………………………………...22
实验九限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24
实验十外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28
实验十一 RNA的提取及其纯度检测……………………………………32
实验十二逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段…………………..35
实验十三 DNA探针制备……………………………………………..…38
实验十四 Southern印迹杂交……………………………………………41
实验十五 Northern印迹杂交……………………………………………44
实验十六荧光原位杂交(FISH)技术…………………………………47
实验十七外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50
实验十八生物芯片技术………………………………………………...53
实验十九 RNAi技术……………………………………………………56
实验二十蛋白质组技术………………………………………………...58
附录基因工程基本技术路线…………………………………………….60
实验一质粒的提取和纯化
实验目的:了解碱裂解法制备质粒的原理,掌握质粒的小量制备方法。
实验原理:质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术,现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法;利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中,开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法;利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol/L尿素,=)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链,质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。
1. 裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法,通常有煮沸法、非离子型去污剂