实时荧光定量pcr.ppt

文档介绍：实时荧光定量PCR
临床医学研究中心
第一步 RNA提取
将实验试剂、移液器、枪头、离心管等物品提前放入指定的超净工作台内,紫外照射三十分钟以上。
第一步 RNA提取
具体步骤可查看《总RNA提取实验原理、步骤》,以下配合图片进行简要介绍。
一、抽提:加入Trizol,充分抽吸,移液至离心管;
二、分相:加入***仿,震荡混均后静置。
震荡前***仿位于Trizol上方
使用震荡器充分混匀静置后,***仿位于Trizol下方
第一步 RNA提取
离心后,分相为三层
上层:RNA
(约为Trizol的60%)
中间:DNA
下层:蛋白质
(酚-***仿)
将上清RNA移至另一
无酶离心管(尽量避免吸到中间DNA)
第一步 RNA提取
三、RNA沉淀:加入异丙醇析出RNA。
RNA沉淀将在离心底的侧面形成。
四、RNA清洗并溶解,测浓度。
第二步 cDNA模板的合成
利用提取的RNA样品,合成cDNA模板。具体步骤按照使用的试剂盒说明书进行。
使用普通PCR仪进行相应的步骤。
第三步待测样品的待测基因加样
以takara公司的SYBR Green试剂盒为例
上样体系(20ul):
cDNA———————— 2ul
上游引物——————
下游引物——————
SYBR Green(2x)—— 10ul
ddH2O———————— 7ul
——————————————
总体积 20ul
第四步荧光定量PCR仪的操作
以Roche480为例
一、设定程序:点击模板获取(takara run protocol)
第四步荧光定量PCR仪的操作
绿色点表示采集荧光信号的温度和时间点
第四步荧光定量PCR仪的操作
程序结束进行结果分析