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ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisPekinensis,,(May2021)
doi:-
嗜热蓝细菌PKUAC-E542藻蓝蛋白耐热性以及
不同光照条件对其含量影响研究
李俐珩梁园梅李玫锦陈鹏宇肖萌崔逸璇MaurycyDaroch†
北京大学深圳研究生院环境与能源学院,深圳518055;†通信作者,E-mail:m.******@
摘要对PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性进行测试,探究其热稳定性能。同时,在不同光周期和不同光
质光源组合条件下培养嗜热蓝细菌PKUAC-SCTE542,研究其生长情况和藻蓝蛋白含量,探索适用于藻蓝蛋
白生产的光照条件。选取30°C,40°C,50°C,60°C,65°C,70°C,80°C,90°C为实验组,25°C和4°C为对照组,放
置时间设为5小时和14天,用紫外分光光度计测定藻蓝蛋白全光谱图,考察不同温度和放置时间对藻蓝蛋白
的影响,再将E542-PC的α链和β链与蛋白质晶体结构数据库中藻蓝蛋白进行比对,深入了解其耐热机制。
分别在光波长为白光(400~800nm)、红光(654nm)、绿光(511nm)和蓝光(454nm),光周期为8L/16D,
12L/12D和16L/8D的条件下培养蓝细菌,测定其生物质干重以及藻蓝蛋白含量。结果表明,PKUAC-
SCTE542藻蓝蛋白在65°C环境可以保持稳定,60°C放置14天仍表现出60%的热稳定性。光质为红光、光周
期为16L/8D的条件下,藻蓝蛋白绝对产量最大;光质为红光、光周期为8L/16D时,藻蓝蛋白产率最高。实
验结果表明PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性能较好,经过光照条件筛选,藻蓝蛋白产量可提高近100
mg/gDCW。
关键词嗜热蓝细菌;藻蓝蛋白;热稳定性;光照条件
ThermophilicCyanobacteriaPKUAC-E542PhycocyaninHeatResistance
andEffectsofDifferentLightConditionsonItsAccumulation
LILiheng,LIANGYuanmei,LIMeijin,CHENPengyu,XIAOMeng,CUIYixuan,MaurycyDaroch†
SchoolofEnvironmentandEnergy,PekingUniversityShenzhenGraduateSchool,Shenzhen518055;
†Correspondingauthor,E-mail:m.******@
AbstractThispaperstudiedtheheatresistanceofphycocyaninandtheaccumulationofphycocyaninunder
°C,40°C,50°C,60°C,65°C,70°C,80°C,90°Cas
theexperimentalgroup,25°Cand4°Casthecontrolgroup,theplacementtimewassetto5hoursand14days.
-SCTE542
wasculturedunderdifferentphotoperiodsanddifferentcombinationsoflightsources,anditsgrowthand
phycocyanincontentwerestudiedtoexplorethelightconditionswhichweresuitableforphycocyaninproduction.
Shakingincubatorswithnarrowbandlightatfollowingwavelengths:white(400-800nm),red(654nm),green
(511nm),andblue(454nm),photoperiodsof8L/16D,12L/12D,and16L/8D,
-SCTE542phycocyaninkeptstableat65°Cenvironments,and
stillmaintained60%activityafterbeingplacedat60°
photoperiodof8L/16D,theyieldofphycocyaninwasthehighest;whiletheproductivityofphycocyaninwasthe
highestwhenredlightandphotoperiodof16L/,PKUAC-SCTE542showedgreatheat
,thephycocyaninyieldincreasedbynearly100
mg/gDCW.
Keywordsthermophiliccyanobacteria;phycocyanin;heatresistance;lightcondition
深圳市知识创新计划基础研究项目(JCYJ20180302153648993)和国家自然科学基金(32071480)资助
收稿日期:2020-03-19;修回日期:2021-02-18
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蓝细菌(Cyanobacteria)又称蓝藻,
(Cyanophyta),作为一种光合自养原核生物,可将光用无菌环挑取BG-11平板菌株,接种到装有30
能和CO2直接转化为生物基热稳定性物质。藻胆蛋mL新鲜BG-11培养基的锥形瓶(100mL)中,置于
白是蓝细菌细胞内一组具有发色团的水溶性蛋白,45ºC摇床式光照培养箱中进行培养,转速设定
负责光合作用过程中的光捕获,并将能量逐级传递为120r/min,光暗比设定为16/8小时(光周期L/D),
2
给叶绿素。白炽灯照明,光照强度为70μmol/(m·s),培养至对
蓝细菌中藻胆蛋白含量可以达到细胞总蛋白的数生长期(3~5天);用10%的种子液+90%的BG-11
[1]
50%。根据其吸收波长最大值及色基结构,可分培养基起始,连续培养14天。
为四大类:别藻蓝蛋白(λmax=650~660nm)、
白(λmax=610~625nm)、藻红蛋白(λmax=490~570nm)用已称重的50mL离心管收集嗜热蓝细菌生长
[2]
和藻红蓝蛋白(λmax=560~600nm)。其中,藻蓝蛋液,4000r/min条件下离心10分钟,倒掉上清液,
[3]
白(C-PC)是一种由α亚基和β亚基构成的六聚体,−80°C条件下预冷1小时,置于冷冻干燥机中干燥
[4-5][6-7]
在实验中表现出抗氧化性、抗癌性和抗炎24小时,测定嗜热蓝细菌生物质干重量。
[8]
性,具有优异的临床应用潜力。
,[14]
素分子藻蓝蛋白已被用作某些食品和饮料中蓝色使用Bennett等的方法检测藻蓝蛋白含量。
的来源,但因其蓝色不稳定、不宜受热和对酸碱度取50mg冻干后的藻粉,
,
要求高等问题无法用于需要高温处理的食品。目盐缓冲液(pH=,含Na2HPO4和KH2PO4)将藻粉重
前主要通过额外添加防腐剂或低浓度的糖,来提高悬。将混合液放置于−20ºC冷冻4~5小时,然后
[9]
蛋白质稳定性。耐热性成为藻蓝蛋白市场开发的在9ºC±1ºC的水浴中慢慢解冻。将溶解的样品溶液
阻碍因子之一。因此,开发新型热稳定藻蓝蛋白是进行超声破碎(将装有样品藻液的离心管放入冰水
拓宽其食品工业市场的首要研究方向。嗜热蓝细菌混合物中,用超声波均化器将样品处理90秒,输
作为一种最适宜生长温度高于45ºC的微生物,其胞出9秒,占空比为65%)。将得到的粗提物以10000
内酶和蛋白质在高温时非常稳定,因此可能是热稳r/min(4ºC,10分钟)的速度离心去除细胞碎片,并收
定性藻蓝蛋白的一个潜在来源。天然藻蓝蛋白的产集上清液(实验过程中将样品保存在冰块上并置于
量是其开发应用的另一阻碍因子。藻蓝蛋白是光系黑暗中,避免提取过程中色素降解)。利用分光光
统色素蛋白,而光合细菌的光合作用过程受光质和度计,分别测量上清液在615nm和652nm波长处
光周期等条件影响,不同色素的积累会因光质而改的吸光度A,并根据下式计算藻蓝蛋白(phycocyanin,
[10][11]
变,光照时间过长会减少色素的合成。C-PC)的含量:
本文主要选取嗜热蓝细菌PKUAC-SCTE542为
C-PC(mg/mL)=(A615−)/。
研究对象,对PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐温性
进行考察,为其潜在的市场价值提供科学依据;
响,为利用嗜热蓝细菌生产藻蓝蛋白的光照条件提以嗜热蓝细菌E542藻蓝蛋白(E542-PC)溶液
供优化策略,以期探讨开发嗜热蓝细菌、提取藻蓝OD615=,开展不同温度的耐受实
蛋白的可行性。验。选取30°C,40°C,50°C,60°C,65°C,70°C,80°C,
90°C为实验组,25°C和4°C为对照组,放置时间设
1材料与方法为5小时。采用紫外分光光度计测定藻蓝蛋白全光
,考察不同温度对藻蓝蛋白的影响,每组实验
实验所用菌株PKUAC-SCTE542(简称E542)分设置3个平行样。
离于四川甘孜州温泉带,
[12]
源学院微藻藻种资源库。实验室常规培养嗜热设置上述相同温度梯度及对照组,将放置时间
[13]5
蓝细菌选用BG-11培养基。1×10Pa高温高压灭延长至14天。采用紫外分光光度计测定藻蓝蛋白
菌,固体培养基的配制另加琼脂粉12g/L。全光谱图,考察延长放置时间对藻蓝蛋白的影响,
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李俐珩等嗜热蓝细菌PKUAC-E542藻蓝蛋白耐热性以及不同光照条件对其含量影响研究
每组实验设置3个平行样。相应光质作为光源),待嗜热蓝细菌进入生长对数
,从种子液锥形瓶(100mL)中吸取10mL,转移
选取Geb公司提供的SP-PC配制OD615=-11+
溶液,开展与E542-PC一致的实验(包括温度和放置锥形瓶(250mL)中,光波长设置为白光(400~800
时间),作为种间对照组。采用紫外分光光度计测nm)、红光(654nm)、绿光(511nm)和蓝光(454nm),
定藻蓝蛋白全光谱图,每组实验设置3个平行样。培养周期为14天,
基于上述实验数据,使用非线性拟合Sigmoid算藻蓝蛋白含量,每组实验设计3个平行样。
函数,获取变性过程中热力学参数。藻蓝蛋白最大
2结果与分析
吸收峰达到50%的温度(T50%)采用热稳定实验中S
型曲线计算,焓(ΔH*)和熵(ΔS*)值可以利用van’
Hoffplots演算,公式如下:本文在4°C~90°C之间设置10个温度点,每个
*温度点保持5小时,考察温度变化对E542-PC稳定
△=-GRTKlneq,
性的影响。如图1(a)所示,藻蓝蛋白在615nm处有
△=△-△GHTS***,
最大吸收峰,故以此处吸光度作为分析其热稳定性
K=[]/[],DN
eq的参考值。可以看出,70°C是E542-PC热稳定性发
式中,ΔG*为自由能;[D]为变性蛋白的浓度值,[N]生明显变化的临界温度。70°C以下,吸光度曲线在
为天然蛋白的浓度值,浓度单位均为mg/mL。615nm处均有明显的峰值;70°C以上,吸光度曲线
由热稳定实验数据,利用sigmoidal函数拟合,在615nm处没有明显吸收峰。因此,E542-PC在低
获得线性公式:于70°C时能够维持热稳定性,超出这一温度则可
ln([DN]/[])=-△HRTSR()+△,能破坏藻蓝蛋白的结构。
通过斜率和截距分别计算焓值和熵值。通过对比放置5小时与14天的嗜热蓝细菌
-PC的相对吸光度(%),同时将相同放置条件
SP-PC,
主要通过将α链和β链与蛋白质晶体结构数据下的螺旋藻作为对照进一步探究放置时间
库(PDB)中嗜热和嗜中温藻蓝蛋白进行比对,选择对嗜热蓝细菌E542-PC耐热性的影响,结果如图
被替换的氨基酸残基,分析其稳定性机制。主要执1(b)所示。对比不同温度下两个放置时长的相对吸
(Biomatters,澳大利亚),选光度,发现E542-PC热稳定性因放置时间延长而降
择默认的Geneious比对算法和Blosum62矩阵。低。温度低于30°C时,放置时间的延长没有显著
,吸光度值变化小于10%;当温
2度达到60°C时,放置时间延长会使其热稳定性大
根据预实验结果,70μmol/(m·s)为最适宜E542
,45%5
生长的光照强度。弱光下E542-PC比例上升,但生幅度降低吸光度值变化达。放置时间为小
SP-PC30°CE542-PC
物质很低,总产量不高;强光则使E542无法生长。时的在温度低于时与具有相
因此,本文选择光周期和光质两种因子进行优化,似的变化趋势,但达到40°C后,其热稳定性均低于
实验方法如下。60%。放置14天后,SP-PC在高于30°C的环境中基
。从Thermosynechococcsvulcanus和Ther-
[15]
(选择mosynechococcuselongatusTA-1分离的藻蓝蛋白
相应的光周期),待嗜热蓝细菌进入生长对数期时,与本研究中E542-PC的稳定性具有相似的变化趋
从种子液锥形瓶(100mL)中吸取10mL,转移至装势,但是E542-PC在50°C孵育5小时可以保持90%
有90mL新鲜BG-11+,而TA-1-PC在50°C孵育5小时仅
[15]
瓶(250mL)中,光周期为8L/16D,12L/12D和16L/保持80%以上的热稳定性。
8D,培养周期为14天,,E542-PC的热稳定性
并计算藻蓝蛋白含量,每组实验设计3个平行样。下降。随温度升高,这种趋势更加显著。相较于
-PC短期孵育40°C和长期孵育30°C热稳定性降
(选取低的情况,E542-PC在短期和长期孵育两个实验组
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(a)不同温度下E542-PC孵育5小时紫外/可见光谱吸光度;(b)延长放置时间后E542和螺旋藻藻蓝蛋白的稳定性
图1E542-PC稳定性特征
-PC
都表现出更高的热稳定性。E542-PC与其蛋白晶体结构相似度高。对结果做进
利用sigmoidal函数,拟合不同温度点放置5小一步的比对,发现嗜温蓝细菌和嗜热蓝细菌的藻蓝
时的E542-PC和SP-PC的相对吸光度,得出E542-蛋白氨基酸残基具有显著差异。藻蓝蛋白α亚基氨
PC的T50%=°C(表1),显著高于分离于热带海基酸残基存在特定的取代形式,如在嗜热聚球藻属
[16]
%(50°C),但低中,精氨酸取代了原本嗜温蓝细菌中的谷氨酰***,
[17]
于Cyanidioschyzonmerolae的T50%(83°C)(后者孵形成谷氨酰***-藻胆素键,使其藻胆蛋白更稳定。
育时间仅为30分钟,而E542-PC为5小时);SP-
的T50%(51°C)明显低于E542-PC。比较两株菌株的表2为不同光照条件下E542生物质干重及藻
藻蓝蛋白在55°C下的自由能可知,SP-PC的热变性蓝蛋白含量对比。白光条件下各实验组的生物质干
是一个自发过程,而E542-PC却不是如此,这与已重与光暗比正相关,增加光照时间,可以促进嗜热
[18-19]
报道的螺旋藻藻蓝蛋白稳定性研究结果相一蓝细菌E542的生物量积累。藻蓝蛋白含量没有因
致,进一步表明嗜热蓝细菌E542-PC的热稳定性具光暗比的增大而明显增加,同时,藻蓝蛋白在生物
有显著优势。质中的占比也随光暗比的增大而减小。光照时间增
为了更深入地分析E542的稳定性机制,选择9加对藻蓝蛋白的积累没有明显的促进作用,单位质
株蓝细菌进行多序列比对,菌株名称及比对结果如量生物质的藻蓝蛋白含量存在降低的趋势。
图2所示。E542-PC与Thermosynechococcusvul-红光、16L/8D条件下培养的E542生物质干重
canus,Thermosynechococcuselongatus以及Synech-值最大,藻蓝蛋白积累总量为189mg/gDCW,在12
%,其个实验组中总产量最高。光源为红光时,光周期
中,Thermosynechococcuselongatus与E542-PC的β12L/12D的实验组收获的生物质干重大于8L/16D
亚基同源性在97%以上。序列的高相似性表明,实验组,但前者的藻蓝蛋白积累量比后者少近10
mg/gDCW。这一实验结果与蓝细菌Pseudanabaena
表1E542和螺旋藻藻蓝蛋白孵育5小时蛋白失活热力学
和Anabaenacircinalis在不同光质下的色素积累特
和动力学参数
征一致[9],可能是由于光周期的改变促发蓝细菌的
Table1Thermodynamicandkineticparametersofinactivation
ofpurifiedE542-PCandSpirulinaC-PCcalculated调节机制,E542在光照时间较长时,通过降低藻蓝
for5-hourincubation
蛋白的积累来获取最大的可用光能捕获效率。与白
ΔG(55°C)/
藻蓝蛋白TΔH/(kJ·mol−1)ΔS/(kJ·mol−1·K−1)
50%(kJ·mol−1)光实验组对比可知,在光周期同为8L/16D时,红光
E542-
条件下E542的干重(974mg/L)远大于白光(724
SP-−
mg/L),与白光、16L/8D条件下的干重(995mg/L)接
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表2不同光照条件E542藻蓝蛋白含量对比蓝细菌E542收获量较高,可能是因为实验中采用
Table2SummaryofphycocyaninproductionofE542
underdifferentlightconditions的红光(662nm)不仅可以被叶绿素吸收,还可以被
别藻蓝蛋白吸收,提高光合效率,促使藻蓝蛋白积
生物质干重/藻蓝蛋白/占生物质
光质光周期(L/D)
(mg·L−1)(mg·gDCW−1)的比例/%累量增高[2,21-23];而蓝光可能导致传递光合电子的
[24-27]
8/16724±35108±
PSII能力不足,光合作用效率降低,使得E542
白光12/12895±22109±,影响藻蓝蛋白产量。光周期变化时,
16/8995±34116±
总藻蓝蛋白产量的提升主要归因于生物量的提高,
8/16974±43175±*
光周期8L/16D条件下藻蓝蛋白的占比高于其他两
红光12/121168±66168±
**个光周期。光照时间越长,意味着光合细菌吸收的
16/81432±78189±
光能越多,从而导致光合磷酸化活动频繁,削弱色
8/16516±8158±
素合成通路,使得色素合成量相应地下降[11]。
绿光12/12400±3942±
16/8328±5234±
3讨论与结论
8/16403±2542±
蓝光12/12306±4528±-PC在不同温度、不同放置时间下
****
16/8241±5324±,同时与SP-PC
说明:采用Duncan’smulitiplerangetest方法分析;*表示p<耐热性能进行对照实验。通过改变光照条件,筛选
,**表示p<(n=3)。
最优的E542-PC积累培养条件,得出如下结论。1)
E542-PC在65°C放置5小时后,二级结构稳定,仍
近,可能是由于红光对E542的生长有较好的促进
保持热稳定性;放置时间延长至14天后,E542-PC
作用。
仍能在60°C条件下保持60%的热稳定性;5小时孵
绿光培养下的各实验组,生物质干重和藻蓝蛋
育条件下,其失活温度远高于SP-PC。2)与白光相
白积累量均随光照时长的增加而降低。对比白光实
比,红光(662nm)对E542生长和藻蓝蛋白积累均存
验组可知,光周期为8L/16D时,白光下的生物质
在促进作用,光周期为8L/16D时藻蓝蛋白合成更多,
干重比绿光高40%,藻蓝蛋白是绿光培养的两倍。
单位质量嗜热蓝细菌的藻蓝蛋白可提升近100mg。
同时,绿光下的藻蓝蛋白占比远低于白光,差值达
综上所述,E542-PC比目前市场应用的藻蓝蛋
%。同样的情况也出现在另两个光周期中,其差
白热稳定性能良好,嗜热蓝细菌E542是未来市场
距甚至比8L/16D条件下更大。可以推断,绿光不
化应用开发藻蓝蛋白的一个非常具有潜力的研究对
仅对E542的生长有明显的抑制作用,对其藻蓝蛋
,,
白的积累也有很大的影响。象。但是仅针对光照条件进行筛选是不够的还
需多方位优化培养条件,必要时可以利用基因工程
蓝光培养下E542的生物质干重与有促进作用
的红光实验组数据差异显著,蓝光实验组在光周期技术进行优化,进一步提高其市场化价值。
为16L/8D时收获的生物量最小,约为红光同一光参考文献
周期收获量(最大值)%;其藻蓝蛋白产量仅
[1]McInerneyMJ,BryantMP,
有24mg/gDCW,约为红光同一光周期实验组的
bacteriumthatdegradesfatty-acidsinsyntrophic
%。此外,蓝光实验组藻蓝蛋白占生物质的比
-
例基本上低于10%,表明蓝光抑制E542生长的同
biology,1979,122(2):129-135
时,也会抑制其藻蓝蛋白的积累过程。
[2].
,
分析不同光质条件下的藻蓝蛋白含量可知红BiochimicaetBiophysicaActa-Bioenergetics,2004,
光条件下积累的藻蓝蛋白含量最高,白光次之,绿1657(2/3):73-81
光和蓝光积累量较低。与模式菌Synechococcuselon-[3]AdirN,DinesM,KlartagM,
[20]
,disassemblyofphycobilisomes//ComplexIntracellular
E542基因组中并不具备藻红蛋白相关编码基因,,2006:47-77
法实现颜色适应(CCA)调节。红光实验组中的嗜热[4]RomayC,ArmestoJ,RemirezD,
534
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李俐珩等嗜热蓝细菌PKUAC-E542藻蓝蛋白耐热性以及不同光照条件对其含量影响研究
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