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中国皮肤性病学杂志
TheChineseJournalofDermatovenereology
ISSN1001-7089,CN61-1197/R
《中国皮肤性病学杂志》网络首发论文
题目:紫草油对激素依赖性皮炎豚鼠模型的影响及机制
作者:马文礼,马小娟,马娟弟,张红霞,杨帆,王丽新
收稿日期:2022-06-08
网络首发日期:2022-07-26
引用格式:马文礼,马小娟,马娟弟,张红霞,杨帆,
炎豚鼠模型的影响及机制[J/OL].中国皮肤性病学杂志.
.
网络首发:在编辑部工作流程中,稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶
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췸싧쫗랢쪱볤ꎺ2022-07-2610:26:59
췸싧쫗랢뗘횷ꎺ.
紫草油对激素依赖性皮炎豚鼠模型的影响及机制
1,21,21111,2
马文礼,马小娟,马娟弟,张红霞,杨帆,王丽新
[摘要]目的探究紫草油对激素依赖性皮炎(HDD)豚鼠模型的影响及机制。
方法采用完全随机方法将32只豚鼠分为空白对照组、模型组、他克莫司组、
紫草油组。除空白对照组外,%丙酸***倍他索酊剂建立
HDD模型,模型建立后,模型组外涂生理盐水,各给药组外涂相应药物,连续
3周。ELISA法测定血清IFN-γ、IL-4、IgE水平;免疫组化和Westernblotting
法检测表皮FLG、LOR及Caspase-14表达情况。结果较之于空白组,模型组
豚鼠血清IFN-γ、IL-4、IgE水平升高[(±)pg/mLvs.(±
)pg/mL、(±)pg/mLvs.(±)pg/mL、(±)
μg/mLvs.(±)μg/mL,P<],表皮FLG、LOR和Caspase-14表达
水平降低,差异均有统计学意义(P<)。较之于模型组,紫草油组及他克莫司
组豚鼠血清IFN-γ、IL-4、IgE水平降低[(±)pg/mL、(±
)、(±)pg/mL;(±)pg/mL、(±)
pg/mL、(±)pg/mL;(±)μg/mL、(±)
μg/mL、(±)μg/mL,P<],表皮FLG、LOR和Caspase-14表
达水平升高,差异均有统计学意义(P<)。结论紫草油对豚鼠HDD具有改善
作用,其机制可能与抑制皮肤炎症反应,促进表皮皮肤屏障形成有关。
[关键词]紫草油;激素依赖性皮炎;炎症;皮肤屏障
[中图分类号][文献标识码]A
TheEffectandMechanismofLithospermumOilonSteroid-Dependent
DermatitisinGuineaPigModel
MAWenli1,2,MAXiaojuan1,2,MAJuandi1,ZHANGHongxia1,YANGFan1,
WANGLixin1,2
(,Yinchuan750004,China;
NingxiaMinorityMedicineModernizationMinistryofEducation,Yinchuan750004,
China)
[Correspondingauthor]WANGLixin,E-mail:wxy2008.******@
[Abstract]ObjectiveThisstudywasdesignedtoinvestigatetheeffectsand
mechanismoflithospermumoilonsteroid-dependentdermatitis(HDD)inguineapigs.
MethodsTotalof32maleguineapigswererecruitedandrandomlydividedinto
normalgroup,modelgroup,tacrolimusointmentgroup,
基金项目:“宁夏高等学校科学技术研究项目资助”(项目编码:NGY2018-90);
殊人才启动项目(项目编码:XT2017024)(项目编码:X202210752055)
作者简介:马文礼,男,硕士生,研究方向为中医药治疗皮肤病,Tel:**********E-mail:******@
通讯作者:*王丽新,女,博士,副教授Tel:**********E-mail:wxy2008.******@:.
%Clobetasolpropionate
,modelgroupsmearednormalsaline,therest
-γ,IL-4
andIgEintheguineapigsserumweredetectedbytheELISA;theproteinexpression
levelsofFLG,LORandCaspase-14intheepidermisofguineapigsweredetected
thenormalgroup,theIFN-γ,IL-4andIgEofguineapigsseruminthemodelgroup
weresignificantlyincreased[(±)pg/mLvs.(±)pg/mL,
(±)pg/mLvs.(±)pg/mL,(±)μg/mLvs.(
±)μg/mL;P<];theFLG,LORandCaspase-14ofguineapigs
epidermisinthemodelgroupweresignificantlydecreased(P<);comparedwith
themodelgroup,theIFN-γ,IL-4andIgEofguineapigsseruminthelithospermum
oilgroupandtacrolimusointmentgroupweresignificantlydecreased[(±
)pg/mL,(±),(±)pg/mL;(±)
pg/mL,(±)pg/mL,(±)pg/mL;(±)
μg/mL,(±)μg/mL,(±)μg/mL,P<];the
FLG,LORandCaspase-14ofguineapigsepidermisinthetacrolimusointment
groupandlithospermumoilgroupweresignificantlyincreased(P<).Conclusion
LithospermumoilcanimproveguineapigHDD,andthemechanismmayberelated
toinhibitingskininflammationandpromotingtheformationofepidermalskinbarrier.
[Keywords]Lithospermumoil;Corticosteroiddependentdermatitis;Inflammation;
Skinbarrier
糖皮质激素因其显著的调节免疫、抗炎、美白等作用,被广泛用于多种皮
肤病的治疗。长期应用后停药易诱发停药反应,表现为皮肤红斑、痤疮、脱
屑,并伴有刺痛、烧灼、瘙痒等不适,恢复用药后皮损可缓解,使患者身体及
[1]
心理产生依赖,严重影响患者身心健康。皮肤屏障分布于皮肤最外层,作为
机体与外界环境隔离的最关键结构,对维持机体内环境稳态和抵御外来物质的
侵袭具有重要作用。兜甲蛋白(LOR)作为皮肤屏障最主要蛋白,其含量占角质
层总蛋白80%,另一关键蛋白质丝聚蛋白(FLG)经半胱氨酸蛋白酶-:.
14(Caspase-14)切割分解为游离氨基酸,为皮肤提供天然保湿因子,维持皮肤水
[2]
分。HDD的特征性表现为皮肤屏障相关蛋白的破坏,随着皮肤屏障破坏,角
[3]
质形成细胞衍生的炎症级联反应启动,辅助性T细胞和嗜酸性粒细胞增多。
[4]
紫草油为皮肤科常用制剂,临床报道其对多种皮肤病疗效显著,但目前对
其作用机理的研究尚匮乏。本研究以紫草油对HDD豚鼠进行干预,从调节免
疫和皮肤屏障修复机理角度探讨其作用机理,为临床用药提供理论支撑。
1材料和方法
,体重(330±20)g,购自宁夏医
科大学实验动物中心[许可证号:SYXK(宁)2020-0001]。实验研究已通过宁
夏医科大学动物伦理委员会审查(批准代码:IACUC-NYLAC-2021-053)。
***倍他索粉剂(中国食品药品检定研究院,批号:100302-
201804)。%他克莫司软膏(浙江万晟药业有限公司)。紫草药材(宁夏明
德中药饮片有限公司,批号:20210201)。芝麻油(上海太太乐食品有限公
司)。
-4(JL21520)、IFN-γ(JL11665)、IgE(JL11287)ELISA
试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。FLG(美国Affinity,DF13653);
LOR(美国ThermoFisherScientific);Caspase-14(美国Novus)。%胰酶
蛋白消化液(北京索莱宝科技有限公司,T1350);山羊抗兔的二抗、山羊抗鼠
的二抗、DAB显色剂、ECL发光试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,
ZB2301、ZB2305、ZLI-9018、SC-2048)。
-11(美国丹诺尔);BP310P
型称量天平(德国Sartorius公司);Centrifuge5417R型低温高速离心机(德国
Eppendorf公司)。
,粉碎,以10倍量芝麻油浸泡药材1h
[5]
后,145℃高温加热1h后,放置冷却即得。
×5cm区
域脱去毛发。随机选取8只豚鼠作为空白组,右侧涂抹75%酒精,左侧涂抹:.
[6]
%生理盐水,%丙酸***倍他索酊剂,左侧涂抹75%
酒精,2次/d,连续7周。
,即模型组、治疗
组、阳性对照组。%生理盐水,治疗组右侧皮肤涂抹紫
草油,%他克莫司软膏,2次/d,连续3周。
、皮肤镜及红外成像系统检测使用皮脂检测仪、皮肤镜分
别对上述4组豚鼠双侧皮肤于治疗前、治疗后进行检测,对皮肤水分、油分重
复检测3次,取均值作为皮肤水分、油分值;皮肤镜采集皮肤组织图像;红外
成像系统测量双侧皮温。
,以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后,心尖取
血,3500r/min条件下离心15min,取上清液用冻存管分装后,置-80℃冰箱
保存。取豚鼠双侧脱毛区完整皮肤,部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,剩余部
分用冻存管分装后,置-80℃冰箱保存。
,参照ELISA试剂盒说明对血清
IL-4、IFN-γ、IgE水平进行检测。
%多聚甲醛溶液固定后组织,经常规
脱水、石蜡包埋、切片(厚度为5μm),HE染色后封片,置于光学显微镜下
观察(×200)。
、LOR和Caspase-14蛋白表达将切片常规
脱蜡至水、经抗原高压修复、孵育、血清封闭、滴加PBS稀释后的一抗,湿盒
内4°C孵育过夜、PBS洗涤3次,5min/次、滴加HRP标记的二抗,室温孵
育30min、同法洗涤3次、滴加新配的DAB显色液显色、苏木素复染细胞
核、脱水封片、镜下观察采图(×400),细胞核为蓝色,阳性表达为棕黄色。
、LOR和Caspase-14表达将皮肤
%胰酶蛋白消化液中4℃浸泡16h后,轻轻揭下表皮层,称取50
mg剪碎,于液氮中研磨至细粉状,分装至离心管,加入RIPA裂解液500μL,
混匀,4℃放置过夜后,12000r/min,4℃条件下离心10min,取上清液。运
用超微量紫外可见分光光度计测定蛋白浓度,95℃条件下变性10min。于
SDS-PAGE凝胶上样后电泳,PVDF转膜,5%脱脂奶粉室温下封闭2h,加入:.
PBS稀释后的一抗,4℃过夜。PBST液洗涤3次,10min/次。加入PBST稀
释后的二抗,作用90min,同法洗涤后,暗盒中采用ECL法显影,扫描胶片,
Image-J软件测定条带灰度值。
,所有计量资料均符合
正态分布,以x±s方式表示,多组间数据比较采用单因素方差分析,P<
表示差异有统计学意义。
2结果
、油分含量及皮温比较与空白组相比,模型组水分、
油分含量显著降低,皮温升高(P<);与模型组相比,紫草油组、他克莫
司组水分、油分升高,皮温降低(F水分=,F油分=,F皮温=;P<
)。
表1各组豚鼠水分、油分及皮温比较(x±s,n=8)
,oilcontentandskintemperatureofguineapigsineachgroup
(x±s,n=8)
GroupMoisture%Oil%Temperature℃
±±±
±±±
±±±
±±±
Note:aComparedwiththenormalgroup,P<;bComparedwiththemodelgroup,P<.
,模型组豚鼠皮肤可见毛细血管扩
张,表面散在鳞屑覆盖;与模型组相比,紫草油及他克莫司组可见鳞屑消退,
毛细血管扩张改善(图1)。
NormalgroupModelgroupLithospermumoilgroupTacrolimusgroup
up图1各组豚鼠皮肤镜特征
.
,模型组豚鼠表皮角质层角
化不全,表皮增生,棘层肥厚,表皮突下延呈杵状,真皮浅层致密的炎症细胞
浸润(黄色箭头示);与模型组相比,紫草油组及他克莫司组角质层增厚,表:.
皮增生及真皮浅层炎症细胞浸润改善(图2)。
NormalgroupModelgroupLithospermumoilgroupTacrolimusgroup
图up2各组豚鼠皮肤组织HE染色(×200)
(×200)
-4、IFN-γ、IgE水平变化与空白组相比,模型组豚鼠
血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平均升高,差异具有统计学意义(P<);与模
型组相比,紫草油组、他克莫司组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平均降低,
差异具有统计学意义(FIL-4=,FIFN-γ=,FIgE=;P<),见表
2。
表2各组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平变化(x±s,n=8)
-4,IFN-γandIgElevelsinserumofguineapigsineachgroup(x±s,n=8)
GroupIL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)IgE(μg/mL)
±±±
±±±
±±±
±±±
Note:aComparedwiththenormalgroup,P<;bComparedwiththemodelgroup,P<.
、LOR和Caspase-14蛋白表达情况免疫组织化
学结果示,FLG、LOR和Caspase-14主要表达于表皮角质层、颗粒层以及真皮
层毛囊周围(图3)。Westernblotting法检测结果示(图4),较之于空白组,
模型组表皮组织FLG、LOR和Caspase-14表达显著下调(P<);较之于
模型组,紫草油组及他克莫司组显著上调FLG、LOR和Caspase-14表达
(FFLG=,FLOR=,FCaspase-14=;P<)。:.
NormalgroupModelgroupLithospermumoilgroupTacrolimusgroup
图3各组豚鼠表皮组织FLG、LOR和Caspase-14免疫组化结果(×400)
,LORandCaspase-14inguineapigepidermis
ofeachgroup(×400)
4a4b
4c4d:.
Note:Comparedwithnormalgroup,#P<,##P<;comparedtomodelgroup,*P<
,**P<.
4aElectropherogramofFLG,LORandCaspase-14expressioninguineapigepidermisof
eachgroup;4bFLGexpressionresult;4cLORexpressionresult;4dCaspase-14expression
result
图4Westernblotting法检测各组豚鼠表皮组织FLG、LOR和Caspase-14表达结果
,LORandCaspase-14in
guineapigepidermisofeachgroup
3讨论
HDD的发病机制目前尚不完全清楚,但主要认为与皮肤屏障破坏有关。长
期外用皮质类固醇激素使正常表皮分化受抑制,总蛋白和微丝蛋白等合成减
[3]
少,最终引起皮肤屏障功能缺陷。本研究结果显示,经丙酸***倍他索局部外
用7周后,模型成功建立,表皮组织相关屏障蛋白FLG、LOR和Caspase-14等
被下调,经皮肤失水量(TEWL)增加。
[7-8]
HDD急性损伤期的特征是Th2型细胞因子及IgE抗体的过度表达,IL-
4为经典的Th2型细胞因子,将Th0细胞转化为Th2细胞,并诱导IgE抗体
[9]
合成,致使机体抵抗力降低;研究表明,皮肤干燥、脱屑等也与IL-4过度表
达存在相关性。IFN-γ是一种经典的Th1型细胞因子,在HDD损伤后期,IFN-
[10][11]
γ等Th1型细胞因子大量分泌,进一步促进炎症反应及皮肤损伤;有研究
显示,药物过敏患者血清IFN-γ可过度表达。因此,IL-4、IgE和IFN-γ水平
可作为皮肤炎症严重程度的评估指标。本研究中HDD豚鼠经停用激素制剂
后,血清IL-4、IgE和IFN-γ水平较空白对照组显著升高。
本研究结果显示,HDD豚鼠模型表皮增生,角质层出现角化不全,表皮相
关蛋白表达降低,这可能与炎症级联反应的形成有关。IL-4、IFN-γ可诱导
HDD角质形成细胞的凋亡增加而损伤皮肤屏障,降低表皮中FLG、LOR和
Caspase-14的表达,不断加重皮损程度和延长皮损持续时间,引起表皮增厚及
[12]
角化不全。
紫草油是将紫草以麻油等作为溶剂所提取的一种药物剂型,因其具有抗
[4][13]
炎、抗过敏、调节免疫作用,对多种皮肤病疗效显著。现代研究发现,紫
[14]
草具有抗菌、抗炎、抗氧化、调节免疫等多重药理作用。吴金环等报道,紫
草素作为紫草主要活性成分,能够降低特应性皮炎小鼠血清IL-4表达,减轻皮:.
损处炎症反应,其机制可能与抑制TSLP/OX40L通路有关。紫草素还可降低血清
[15]
IFN-γ及IgE而发挥抗炎作用。
本课题采用紫草油对HDD豚鼠进行干预,发现其可不同程度降低HDD豚鼠血
清IL-4、IgE和IFN-γ水平,这与上述研究中紫草的抗炎功能相一致。紫草油还
可增强表皮组织中FLG、LOR和Caspase-14的表达,促进皮肤屏障的形成,其作
用机制可能与改善皮肤炎症状态有关。
综上所述,紫草油可以抑制皮肤炎症反应的发生,改善表皮增生,恢复受
损的皮肤屏障相关蛋白的表达,降低TEWL。可为HDD的治疗提供新思路。
【参考文献】
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