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菏钾⋯~::’沙辍日期:璮年‘月日期:训月/日日期:劲『暾荚海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明、原创性声明学位论文版权使用授权说明耋途塞堡銮唇澄卮├忌坏生┤恫椤并可按“章程”中规定享受相关权益。凰本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果。知识产权归属海南大学。本人已经认真阅读“咝Q宦畚娜氖菘夥⒉颊鲁獭保饨ū救说难宦畚奶交“咝Q宦畚娜氖菘狻敝腥姆⒉迹法律结果由本人承担。导师签名
摘要巴西橡胶树体胚发生的改良及乳管分化研究巴西橡胶树属大戟科橡胶属,是多年生的异花授粉乔木,在热带地区广泛种植。其所产的天然橡胶是四大工业原料之一,也是重要的战略物资,在国民经济中占有举足轻重的地位。巴西橡胶树花药培养是其遗传改良的重要技术手段,但体胚发生频率低是制约其组培苗工厂化生产和构建遗传转化体系的主要因素。本研究主要围绕如何改良巴西橡胶树花药体胚发生来开展一系列工作。我们对影响花药培养体胚发生的内外因素进行深入研究并对其培养条件进行改良;由于游离小孢子培养具有提高胚胎发生的优点,我们尝试在橡胶树开展这方面的工作;转基因技术是遗传改良的重要技术手段,我们克隆了胚胎发生关键基因并转化橡胶树的花药愈伤,以期获得具高体胚发生能力的转基因株系;我们首次发现花药愈伤中存在乳管细胞,探讨花药愈伤乳管细胞分化与体胚发生关系,对改良体胚发生也有一定的意义。上述这些研究的开展,将对提高橡胶树花药体胚发生和改良其花药培养有着重要的意义。本研究所取得的结果如下:状蜗低逞芯苛讼鸾菏骰ㄒ┯说男翁卣鳌⒆橹赴稹O鸾菏骰ㄒ胚性与非胚性愈伤有着明显差别,前者表现为组织疏松脆性,表面凹凸不平,有较多小球状突起,细胞中含有较大的胞核,细胞形状呈规则小圆球形,细胞排列紧密,细胞体积较小;后者存在两种类型,第一种表现为结构紧密,整块组织硬实,表面较平滑,细胞形态不规则,胞质稀少,部分细胞含有极小的胞核,细胞体积大,第二种表现为组织松软、水渍状,细胞不含有胞核,胞质极稀薄并液泡化,细胞形状不规则,细胞排列较疏松,胞间间隙较大,细胞体积较大。同时发现胚性愈伤发生频率与其体胚发生频率呈极显著相关;胚性愈伤在培养后期细胞合成依然保持活跃,细胞分裂依然旺盛,细胞分化力高。首次对橡胶树花药胚性愈伤胚胎发生的生理生化机制进行深入研究。同一品种的胚性愈伤在整个培养过程中淀粉和蛋白质含量均高于非胚性愈伤,在培养后期开始积累淀海南人学届博貉宦畚模喊土较鸾菏魈迮叻⑸母牧技叭楣芊只芯
可能是促进其向胚胎发生的信号。胚性愈伤的含量与体胚发生频率呈极显韵鸾菏骰ㄒ┨迮呓邢低撤掷啵卜种类型;首次发现橡胶树花药体胚再生率;稀土具有提高橡胶树花药体胚发生率的效果,诱导胚胎发生培养基中以添加韵鸾菏饔卫胄℃咦优嘌逑到谐醪窖芯俊P℃咦拥奶崛〔捎昧街植煌良为基本培养基添加外源激素瓺化力。小孢子的分化以揪段V鳎醪交竦眯℃咦臃只南赴藕臀⒂恕M币粉,可能是为体胚发生作准备,为新的发育阶段提供物质和能量。胚性愈伤高含量的蛋白质可能是其体胎发生的关键因素。胚性愈伤中类胡萝卜素含量较高,表明其具有较强的抗氧化能力,使其细胞不易褐化,降低了组织块的褐化程度。高体胚发生频率的品种其胚性愈伤细胞代谢较活跃,分化力较强,从而消耗更多的碳源,同时这种碳源的消耗著相关,可能是胚性愈伤体胚发生的基础。发生过程中产生双体胚现象,该类胚能正常发育成植株。对橡胶树花药体胚发生的培养条件进行改良。’⊥僚嘌Ч罴选方法进行,结果发现以间接研磨法为佳,虽然工作效率低,但污染率低、杂质少、培养效果好。对小孢子进行不同的预处理试验,发现用ご硪涸ご理小孢子有利于小孢子分化。比较两种不同的碳源培养效果,发现麦芽糖培养效果好。对诱导培养基中的值、组分进行研究,发现诱导培养基值为时,以改诱导效果好,小孢子分化率达ァ0臀飨鸾菏饔卫胄℃咦臃只览祷蛐停挥泻?的小孢子具有分橡胶树小孢子为受体进行电激转化试验,瞬时表达结果证明外源基因已导入部分小孢子基因组中。韵鸾菏髌分植究花药愈伤为受体,采用农杆菌介导法将胚胎发生基因转化橡胶树。结果表明:卡那霉素选择压以为最佳;