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畜牧兽医学报2022,53(8):2652-2662
ActaV(t(rinaria(tZoot(chnicaSinica
).-(资源服务"
标识码(OSID)
鸡毒支原体MG-HY株感染鸡气管的转录组学分析
吴春琳S钟乐苗S赵妍S李文迹4,黄晓紫S吴异健1!!*
(,福州350002;
高等学校重点实验室,福州350002;,
福州350002;(南平)生物科技股份有限公司,南平354200)
摘要:旨在进一步探究鸡毒支原体(MG)感染SPF雏鸡后气管基因组转录水平的变化,筛选出MG感染后参与
气管黏膜炎性损伤的差异表达基因和调控通路。使用MG-•羽1经点眼滴鼻感染SPF雏
鸡,感染后收集气管组织利用RNA-Seq技术进行测序分析。转录组分析结果显示,在MG感染期间RNA-seq共
筛选出3112个显著()差异表达基因(DEGs),其中%646个上调基因%466个下调基因&GO功能分析
显示,差异基因主要涉及生物调节、刺激的反应、多细胞生物过程、细胞成分组织或生物发生等生物过程&KEGG-
Pathway分析发现差异基因参与黏膜免疫信号传导通路,例如:细胞因子-细胞因子受体相互作用,细胞黏附分子
(CAMs),细胞外基质(ECM)受体相互作用、紧密连接、PPAR信号通路和MAPK信号通路等,表明这些基因参与
了MG诱导的雏鸡气管炎症反应和损伤。使用qRT-PCR验证与黏膜免疫相关的13个差异表达的基因,其结果与
转录组分析一致。本研究为进一步阐明MG感染导致宿主气管黏膜上皮损伤和黏膜免疫机制提供了基础&
关键词:鸡毒支原体;RNA-seq;黏膜上皮;差异表达基因;免疫应答
中图分类号::A文章编号:0366-6964(2022)08-2652-11
TranscriptomicAnalysisonResponsesofChickenTracheato
MycoplasmagallisepticumStrainMG-HYInfection
WUChunlin1%ZHONGLemiao1%ZHAOYan1%
LIWenji4,HUANGXiaoii1,WUYijian123*
(,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou
350002,China
WesternVeterinaryMedicineandAnimalHealthcareinFujianProvinee,Fuzhou350002,
China(yLaboratoryofTraditionalChin(s(V(t(rinaryM(dicin(andAnimal
Heahh,FujianAgricultureAndForestryUniversity,Fuzhou350002,China
)
Abstract:TofurtherexplorethechangesoftranscriptionleveloftrachealgenomeafterMyco-
plasmagalispticum(MG)infec-ioninSPFchickens-hediferen-ialyexpressedgenesandreg-
ula-orypa-hwaysinvolvedininflamma--rachealmucosaaf-erMGinfec-ionwere
screenedTheinfec-ionmodelwases-ablishedbyinfusingSPFchickenswi-hMG-HYs-raina-
-her--edand-henusing
收稿日期2021-12-01
基金项目:高校产学合作项目(2022N5001);畐建省自然科学基金项目(2017J01597);福建农林大学科技创新专项基金项目(CXZX2018023)
作者简介:吴春琳(1995-),男,福建光泽人,硕士生,主要从事兽医微生物与免疫学研究,E-mail:******@钟乐苗(1995-),女,江西
赣州人,硕士生,主要从事兽医微生物学与免疫学研究,E-mail:******@。吴春琳和钟乐苗为同等贡献作者
*通信作者:吴异健,主要从事兽医微生物学与免疫学研究,E-mail:******@:.
8期昊春琳等:鸡毒支原体MG-HY株感染鸡气管的转录组学分析2653
RNA-
totalof3112significantly(P<)differentiallyexpressedgenes(DEGs)wereselectedby
RNA-seqduringMGinfection,including1646up-regulatedgenesand1466down-regulated
,onalanalys,sfoundthatd,ferentalgenesma,nly,nvolveb,olog,calprocesses
suchasbiologicalregulation,stimulusresponse,multicellularbiologicalprocesses,cellcompoF
-PathwayanalysisshowedthatdifferentialgenesareinF
volvedinmucosalimmunesignalingpathways,suchas:cytokine-cytokinereceptorinteractions,
celladhesionmolecules(CAMs),extracellularmatrix(ECM)receptorinteractions,tightjuncF
showedthatthesegenesmaybeinvolvedinMG-inducedtrachealinflammatoryresponseandinjuF
-PCRtoverify13differentiallyexpressedgenesrelatedtomucosalimmuF
nity,-
therelucidatingthehosttrachealmucosalepithelialdamageandmucosalimmunemechanism
causedbyMGinfection.
Keywords
MycoplasmagallisepticumRNA-seqmucosalepitheliumdifferentiallyexpressed
geneimmuneresponse
*Correspondingauthor:WUYijian,E-mail:******@
鸡毒支原体=Mycoplasmagallisepticum,MG)炎性病变和黏膜免疫反应机制仍有待探索&
是一种大小介于细菌和病毒之间的微生物,富含黏转录组测序已被应用于提供对分子机制的新见
附蛋白,能顽固地黏附在呼吸道或泌尿道上皮细胞&解,并探索宿主与病原体之间的相互作用因此,
能够引发鸡、火鸡及其他禽类的严重慢性呼吸道疾本研究首先利用MG-HY株菌液建立SPF雏鸡感
病BCRD)'1(。典型症状表现为咳嗽、流浆液性鼻染模型&随后,使用RNA-seq分析探索了感染组和
液、湿性啰音。MG自报道以来广泛分布于世界上对照组气管的全面基因表达谱&将表达量不同的基
所有的养禽国家,每年给各养殖户带来严重的经济因BDEGM进行功能注释和分类,为鸡气管黏膜免疫
损失。据统计,鸡群在遭受MG感染之后弱雏增长相关基因的鉴定提供参考&最后,为了进一步证实
率在10%左右;蛋鸡的产蛋量下降20%左右;肉鸡转录组分析的结果,作者使用qRT-PCR验证了一
减重近40%閃。国内外学者对MG感染的研究超些免疫相关基因表达,包括黏附分子(ALCAM、
过了60年,但MG感染仍然是现代集约化养禽业CD34、NECTIN1、CDH3)、炎性细胞因子(TNF'、
的防控重点旧。IL-邛、IL18、IL1R1)和趋化因子BCCL4、CXCL8、
目前,疫苗仍是预防鸡毒支原体感染的主要方CXCL13、CXCL14、CCL20)。该数据为进一步研究
法,特别是在种鸡预防方面。然而,疫苗对MG感MG与宿主之间的相互作用基,对上
染不能完全保护,这可能是由于对MG与宿主相互MG感染的防治具有重要的指导意义&
作用以及宿主在感染后的免疫反应等方面认识有
限。以往的研究证实了MG的致病作用与其在代1材料与方法
谢过程中产生的神经氨酸酶、过氧化氢酶、
酶、溶菌酶或溶血素有关;也与出现在早期定植过程SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司,
中的Gapa、CrmA和Pvpa等黏附蛋白存在高度相SPF雏鸡由实验室自行孵化饲养&MG-HY株
关性[45]&此外,体外鸡胚气管环研究检测发现,几LTOC-,由本实验室分离
种趋化因子和炎性细胞因子的表达释放,包括IL-鉴定保存⑷&
18JL-邛、TNF'、IFN-*、CCL20等[67],
性病变存在高度相关性&尽管人们对MG与宿主将60只1日龄的健康SPF雏鸡随机分为两组
之间的互作有所了解,但MG感染引起鸡气管黏膜(n=30M,按照标准的育雏方法隔离饲养,两组饲养:.
2654畜牧兽医学报53卷
管理条件一致。在20日龄时,,org/)鉴定富集的生物学过程。
•羽 1的MG-最后,为了解DEGs相关的生物学途径,使用由
HY菌液和灭菌生理盐水,每日观察各组鸡只的临KEGG自动注释服务器(KAAS)(http
//-
床症状,/)运行的京都基因与基因组百
录。于接种后3、5、7和15d,每次随机抽取6只雏科全书(KEGG)途径分析程序来获得功能注释&所
鸡进行心脏采血处死后剖检,先观察气囊病变,根据有表达数据的统计和可视化均通过R包软件进行
Zhang等'10(的研究方法,评估气囊病变&后迅速采(http
//-/)T1415N&本研究中讨
集气管组织&将部分气管组织用4%多聚甲醛固论的所有数据均已录入NCBI的基因表达综合数据
定,进行组织病理学分析&剩余的气管样品放置库(GEO),收录号为SRR5186264。
-80C保存备用&-PCR验证
-PCR定量气管中的MG负荷为了验证细菌感染气管差异表达基因的测序结
为了测定侵入气管内的细菌载量,在感染后3、果,选择黏附分子、细胞因子和趋化因子差异表达的
5"和15d(分别记作3、5、7和15dpi)无菌取雏鸡基因(ALCAM、CB34、NECTIN1、CDH3、TNF-a、
气管(每组n=6),使用PBS冲洗后称取100mg组织IL18、IL1R1、IL1)、CCL4、CXCL13、CCL20、CX-
在无菌条件下匀浆&按参考文献T11N建立的鸡毒支CL14)进行qRT-PCR,检测这些选定基因的mRNA
原体qRT-PCR检测方法,使用RocheLightCycler水平&-actin被用作参考基因以标准化靶基因的
仪器(Roche,上海)通过qRT-PCR检测雏鸡气管中转录水平[16(&根据NCBI中鸡(Gallusgalus)的参
MG的DNA含量&,引物相关信
&qRT-PCR检测信号通路相关基因表达
将气管组织保存在干冰中送SangonBiotech有量的数据采用相对定量2=方法进行计算[17],使
限公司进行测序分析,采用TotalRNAExtractor用GraphPadPrism8软件展开表达量分析(在
(Trizol)提取试剂盒提取样品的TotalRNA,经qRT-PCR反应中,设^actin为内参)。
(The-
mo,上海)评估合格后,使用SangonBiotech(上海)2结果
的Illumina测序平台(HiseqXTen)
库进行测序[12]&雏鸡在感染MG后3d(3dpi)均无明显临床症
-Seq数据分析状出现;7dpi,感染组个别雏鸡首先出现轻微的呼
HiseqXTen系统生成的原始序列数据首先运吸道症状;15dpi,感染组所有鸡均出明显的呼吸啰
用Fast-QC(-音,有4只鸡表现出咳嗽、眼部肿胀等症状&直至全
/)做质量评估,去除3’群剖杀前,各组鸡均未出现死亡&
端测序接头序列和低质量(质量低于20个碱基)的在3、5、7和15dpi,对雏鸡进行剖检,剖检结果显
碱基。干净读数以FASTQ格式存储并用于定量分示,感染组的鸡出现不同程度的气囊炎,气囊颜色浑
析。然后采用MapSplice软件将过滤后序列与浊和气囊壁增厚&对照组鸡均无明显病变,气囊透明
NCBI数据库Gallusgallus参考基因组进行比对,无分泌物&雏鸡气管中的细菌DNA含量统计如图1
通过使用Picard工具(http
//,在健康雏鸡气管中未检测到MG但感染组样
net/)确定映射到每个基因的读数总数来推断每个本细菌载量在3dpi约为1X10zcopies•%L-1,5dpi
基因的转录水平&运用DESeq软件进行差异表达约为1X103copies•%L-1,在7和15dpi显著增长,
的基因筛选,以log2FC>1或<-1且FDR<•%L-1&
为阈值筛选差异表达基因,
基因,通过基于MA绘图分析得到表达强度值[13(&15dpi染组和对照组的气管组织样
,分别获得了超过5500万条
对DESeq软件鉴定的log倍数变化'2的原始读数,质控后得到读数分别为57745164
DEGs进行分析,通过基因本体(GO)(http//(9&05%)、54132380(9&35%)&定位到鸡参考:.
8期吴春琳等:鸡毒支原体MG-HY株感染鸡气管的转录组学分析2655
表1qRT-PCR引物
Table1qRT-PCRPrimers
基登号引物序列5$30片段小/bp
GeneAccessionnumberSequenceProductlength
:AATGATGACAACAGCGAAAAGG111
R:CACATAGAGCCAGTAGACAACACC
:GTGCCACAACATCAAAGACG239
R:GGAGCACATCCTAGCAGGA
:ACCGAATGCGAGTGATTACCT92
R:GGTCTGACAGTGGGGCGTA
:CGGTGACGGACCAAAATGA169
R:TGGCTGAGGATGGAGTAGGC
TNF-:TGATCGTGACACGTCTCTGC88
R:CAACCAGCTATGCACCCCAG
R:CTTCTGCCAAAACAAGTCGC
:TGTGAGAAAGAGCATGGGAAAA133
R:CGAACTTAAAAGCCTTGGAGC
IL1):AGCAGCCTCAGCGAAGAGACC91
R:GTCCACTGTGGTGTGCTCAGAATC
:CTGCCCATCCCTCCCTCT130
R:CAGCACAATCACCAAACCGT
CCL2"NM_204438F:AGGCAGCGAAGGAGCAC152
R:GCAGAGAAGCCAAAATCAAAC
:GAACCCCAAACGCCAGAA138
R:GAGCCCAGTCCTACGTCAGC
CCL4NM_204720F:CCCCTTGTCATCGGTCAC94
R:AGAGGCAGGAGCAGAGCA
9~actinF:GCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTG204
R:CTCGGCTGTGGTGGTGAAGCTGTAG
7」7」
ms9do有样本的唯一映射读数率均〉90%。此外,所有样
uMG本的GC含量均〉50%以上,样本的基础质量评价
。aControl
兰比指标BQ30M均〉94%(表2)。均一性评估结果显E
VNH(图2),reads分布曲线平滑,未出现有断崖式上升
S9I或者下降。表明转录组文库中的mRNA片段化的
DW)随机性高,可以满足后续分析&
使用R包中的DESeq软件对15dpi雏鸡气管
图1气管中的载量分析的转录组数据进行差异表达分析。结果显示,感染
组与对照组之间共筛选出3112个显著(P<)
基因组,两组分别获得的定位读长为48771234和差异表达基因LDEGs),其中,1646个上调基
50886334,%%,所因,1466个下调基因。通过MA图显示了DEGs:.
2656畜牧兽医学报53卷
表2测序数据质控统计表
Table2QCstatisticaltableofsequencingdata
唯一映射
唯一
GCQ30碱基序列数
原始序列质控后序列有效率/%数比/%
组别比率/%比例/%Numberof
RawQ3"baseAfterqualityResponseRatioofunique
GroupsGCunique
sequencecontrolratemapped
contentproportionmapped
sequences
sequences
对照组55""5413238"
Controlgroup
MG组58888""%%5774516498."5%5"%
MGinfec-iongroup
Coverageprofilealonggenes(Control)CoverageProfileAlongGenes(MG-infection)
7x104-
6xl04-
乩
&J5xl04-
OA
OU
4x104.
3x2
2x104-
1X104
020406080100
基因体百分比Percentileofgenebody(5Y3')基因体百分比Percentileofgenebody(5J3‘)
图2样本的Reads在参考基的均一化分布统计
的分布幅度(图3)。通过NCBI数据库以鸡RefSeq应(886Unigenes)"多细胞生物过程(758UniF
mRNA数据库进行blastn相似性搜索,来实现差异genes)和细胞成分组织或生物发生(677UniF
表达基因的注释&genes)。至于细胞组分,1592和1588个Unigenes
,1188个Uni-
使用生物信息学工具DAVID对通过DESeqgenes被分配到细胞器术语,1015个Unigenes个
的差异表达基因功能进行了GO,以被分配到膜术语。在分子功能类别中,结合(1380
生组文库的基因表达它们的Unigenes)、蛋白质结合(792Unigenes)催化活性
GO,总的差异基11377个GO(774Unigenes)是丰度最高的GO术语(图4)。说
注,其中,1518个GO术语为显著富集(),明感染MG-HY株的气管发生杂的生物
根据GO注释将鸡Unigenes分为生物过程(1986学变化&
Unigenes)、细胞组分(2030Unigenes)-Pathway差异基因分析
(1855Unigenes)&因为一些基因被分为一个以上为了鉴定雏鸡的活跃生物学通路,使用KEGG
的子类别,所以这些子类别的基因总和可能超过注释系统对差异表达的Unigenes进行映射。对
100%&对每个功能类别的前15个GO项进行了富3112个Unigenes进行KEGG注释,以(Q<)
集,并显示在(图4),生物过程类别中最丰富的GO为差异表达基因Pathway富集的显著性(图
术语包括对生物调节(1264Unigenes)A刺激的反5)。结果表明,有827个Unigenes显著富集于30条:.
8期吴春琳等:鸡毒支原体MG-HY株感染鸡气管的转录组学分析2657
loq的通路中,其中,几个表性的通路与鸡的黏膜免
疫系统有关,包括细胞因子-细胞因子受体相互作用
(240Unigenes),细胞黏附分子(CAMs)(178UniF
genes),细胞外基质(ECM)受体相互作用(142UniF
genes)、紧密连接(178Unigenes)、PPAR信号通路
gu
&(48Unigenes)和MAPK信号通路(12Unigenes)
qoqo
PIOB等(表3)对这些途径的分析表明,MG感染影响
曲宿主气管免疫防御反应相关信号通路,使气管正
01
常的生理活动和稳态受到异常调节,最终破坏气管
组织形态的炎症&
-PCR对DEGs的验证
为组的可靠性,对选择黏附分
子、细胞因子和趋化因子差异表达的基因(AL-
CAM、CD34、NECTIN1、CDH3、TNF-a,IL18、
-10-5051015
log2(MeanTPM)IL1R1、IL-1)、CCL4、CXCL13、CCL20、CXCL14)
图3比较组表达差异基因分布火山图进行qRT-PCR检测。结果如图6所示9qRT-PCR
-seq数据的趋势一致。
parisongroup从组的可&
Down
Level2GOtermsofControlVSMG-infectionUp
-8oo
-7oo
Suu
-6oo乩
-5ooJO
.
-4ooO
N
-3oo^
K
-2ooffl
^^^-1oo
^^^^4
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Eu
W3
。
Jfe物过程Biologicalprocess分子功能Molecularfunction细胞成分Cellularcomponent
图4差异表达基因前15个最高的GO富集
:.
2658畜牧兽医学报53卷
KEGGenrichment
ko04974:Proteindigestionandabsorption
ko04060:Cytokine-c