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1、把d)90mmX15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里,放入恒温烤箱屮加热至180°C后,干烤2小时。
2、取X克培养基放入X克蒸憎水,放入高压消毒锅中加热溶化,冷至45°C时,在无菌操作要求下将培养基注入培养皿,每皿约15ml。
3、待琼脂凝固后,将培养基平皿倒置于33°C恒温培养箱中培养48小时,若培养基平皿上确无菌落生长,即可采样用。制备好培养皿宜在2-8°C环境中保存。
4、采样时,一般在100级层流罩中放置3个培养皿,在100000级,10000级按面积大小一般放2个培养]11L。打开培养川1•盖,,再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33°C培养,时间不小于48小时,—。
5、将培养皿举起用肉眼直接计数,用记号笔点记然后用5-10倍放大镜检查是否遗漏,若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠,分辨时仍以2个或2个以上菌落计数,不要漏计培养皿边缘生长菌落,并注意细菌菌落与培养基沉淀物区別。
6、沉降菌测试前,被测洁净室已消毒。被测洁净室温湿度须达到规定要求,静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内,测试状态有静态和动态两种,测试状态选择须符合生产要求,并在报告中注明测试状态。
7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服,静态测试时,室内测试人员不得多于2人。测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台,测试应在净化空调系统正常运行不少于lOmin后开始,对非单向流,100000级以上净化房间,测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。
8、平均菌落数计算:Mi+Mr+Ms
平均菌落数二%+机+伽
n
n—培养皿总数
Mi—1号培养川L菌落数
M2一2号培养川L菌落数
Mu—n号培养川L菌落数
用平均菌落数判断洁净空气中微生物。洁净室内平均菌落数必须低于所选定的评定标准,(100级W1个;10000级W3个;100000级W10个)。若某洁净室内平均菌落数超过标准,则必须对此区域先进行消毒,然后重新采样两次,测试结果均须合格。
人员进出洁净生产区的一般程序:
人员进出无菌操作洁净生产区程序:
无菌医疗器具洁净室环境要求及监测:
监测项目
技术指标
监测方法
监测频次
100级10000级100000级
300000级
温度(°C)
18°c—28°C
1次/班
相对湿度%
45-65
1次/班
水平层流
风速m/s
>————
JC
垂直层流
1次/月
$
换气次数
——$20$15
$12
1次/月
静压差Pa
不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间$5
洁净室与室外大气$10
1次/月
沉降菌数
W1W3W10
W15
GB/T16294-1996
1次/周
附录C(资料性附录)洁净室(区)沉降菌技术要求洁净室(区)沉降菌技术要求
洁净度
澳人利亚TGA
CGMP
(2002年8月16H)
欧盟EUCGMP附录1
(2008年2月)
美国FDA
CGMP
(2004年9月)
药品生产质量管理规范
(1998修订)
级别
(p90nmi
CFU/4ha
(p90mm
CFU/4ha
(p90nun
CFU/4ha
沉降菌/皿,
100
A级
<1
A级
<1
<1
—
B级
W5
B级
W5
W3(1000级)
—
10000
C级
W50
C级
W50
W5
W3
100000
D级
W100
D级
W100
W50
W10
为培养皿暴露时间不超过4h,以平均菌落数表示。
无菌检査法试验步骤
无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染。
1、器具灭菌:培养皿若干个(报纸所好)、试管、剪刀、银子等装入盒中置电热干燥箱内180°C,2小时。
2、硫乙醇酸盐流体培养基(细菌),根据试验实际用量取若干培养基和蒸镭水,煮沸,摇匀,分装至适宜的容器中,瓶塞封口,灭菌。硫乙醇酸盐流体培养基置33°C培养48小时,应无菌生长。
改良马丁培养基(真菌),根据试验实际用量取若干培养基和蒸慵水,煮沸,摇匀,分装,灭菌。改良马丁培养基置24°C培养72小时,应无菌生长。
营养琼脂根据实际用量按一皿装15ml,分装几个皿来计算,灭菌。
%***化钠分装至7支试管,封口,灭菌。
3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下,%***化钠试管中摇匀,作10倍系列稀释至10-7,然后从10-、10/式管各抽取lml,分别放入标号5#、6#、7#培养11IL里,倒入营养琼脂摇匀,(营养琼脂不能太烫,以不烫手为准)待营养琼脂冷却后倒置放入33°C培养箱中培养48小时,48小时中取出观察计数,根据菌落数小于
lOOcfu来决定用几号。
4、操作时,应用适当的消毒液对供试品表面或外包装擦拭消毒后,以无菌方法取内容物。取供试品3只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。一只瓣月莫接种于硫乙醇酸盐流体培养基屮,轻轻摇动,使瓣月莫与培养基混合,1支试管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液51,作阳性对照,1支作空白对照。另取2只瓣膜接种于改良马丁培养基中,2支试管作空白对照。硫乙醇酸盐流体培养基置33°C培养,改良马丁置24°C培养阳性对照管培养48小时后应有菌生长。
5、结果判断:在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养14天后,若供试品管匀澄清,判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长,判供试品不符合规定。
细菌内***试验步!
1、准备工作:
移液管:,lmllO支
试管:10mlX4支,试管架2个(大小)
烧杯40ml2个,锥形瓶2个
试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内***,玻璃器皿置电热干
燥箱内180°C干烤至少2小时。
细菌内***检查水10mlX4支
细菌内***工作标准品1支,每安甑含内***10EU
同一批号3支瓣膜
浸提介质:细菌内***检查水浸提介质体积计算公式:(ml)
=(ml)
把细菌内***检查水4支外表擦净打开,倒入烧杯中,
倒入装3只瓣膜烧杯中,用锡纸封口,放进提前打开升温至37°C恒温培养箱中,。供试液贮存应不超过2小时。
注:V-浸提介质体积,单位为毫升(ml)
L-产品细菌内***限值,单位为细菌内***单位每毫升(EV/ml)
入-所用鲨试剂灵敏度标示值,单位为细菌内***单位每毫升(EV/ml)
2、细菌内***工作标准品用细菌内***检查水lml溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟。
。
。(阳性对照溶液)
。
。(供试品阳性对照溶液)
3、把8支鲨试剂外表擦净全部打开放进试管架中,***检查水,在旋涡器上混匀,其中2支作供试品管,2支作阴性对照管,2支作阳性对照管,2支作供试品阳性对照管。
;;;。封闭管口,轻轻摇匀,垂直放入37±1°C恒温器中孵育60土2分钟,然后取出观察结果,试管在孵育期间应避免任何振动。
4、结果判断:将试管从水浴箱中轻轻取出,缓缓倒转180若管内形成凝胶,
并且凝胶不变形,不从管壁滑脱者为阳性(+),未形成凝胶或形成凝胶不坚实,变形并从管壁滑脱者为阴性(一)。阴性对照管均为阴性,阳性对照管,供试品阳性对照管均为阳性,试验有效,否则无效。若阴性对照管为阳性,表明鲨试剂或检查水或实验器具受污染;若阳性对照管为阴性,表明鲨试剂或标准内***已失效,或鲨试剂灵敏度及标准内***效价标示不准确或标准内***稀释有误。供试品阳性对照管为阴性,表明反应体系内有抑制反应干扰因素存在。
—>***化物
1、配制标准溶液:***银溶液。
***银,定溶至100ml容量瓶中,转入棕色试剂瓶中,避光保存,贴标签。
2、取样,量取50ml样品水平行样(2份)倒入试管中,加5滴***,再加入lml***银。均不得发生浑浊。
二、硫酸盐
1、配制标准溶液:称取5±***化顿(分析纯),定溶至100ml容量瓶,倒入试剂瓶,贴标签。(如果浑浊,把蒸馆水烧开,放凉再用)
2、分析:取样50ml平行样(2份)倒入试管中,加2ml***化顿溶液,不得发生浑浊。
三、钙盐
1、配制标准溶液:
,定溶至100ml容量瓶,贴标签。
2、分析:取样50沁平等样2份,倒入试管中,加2nd草酸镀溶液,均不
得发生浑浊。
四、二氧化碳
1、配制标准溶液:
,定溶至100ml容量瓶,用橡皮塞塞紧,用力
振摇,放置1小时,用时取清液。
2、分析:取样25ml平等样(2份)倒入带盖的试管中,加25ml氢氧化钙
溶液,放置1小时,振摇,1小时内不得发生浑浊。
五、易氧化物
1、配制标准溶液:①高猛酸钾溶液:,加水1050ml,煮
沸15分钟,加水到1000ml,密塞后静置2天以上,用微孔玻璃漏斗过滤,摇匀,标定其浓度。
②稀硫酸:取分析纯硫酸(98%)57ml,(注意烧杯里放蒸慵水,沿杯壁缓慢倒入硫酸57ml,定溶至1000ml,放凉再用)
2、标定:取在105°,精密称定,加新沸过冷水250ml与硫酸10ml搅拌使溶解,自滴定管中迅速加入本液约25ml,待
褪色后,加热到65°C,继续滴定至溶液显微红色并保持30秒钟不褪;当滴定终了时,溶液温度应不低于55°C,每lml高镭酸钾滴定液(),根据本液消耗量与草酸钠取用量,算出本液浓度,即得。
贮藏:置玻璃塞棕色玻璃瓶中,密闭保存。
3、分析:取样100ml平行样(2份)加稀硫酸10ml,煮沸后,加高镐酸钾滴定液(),再煮沸10分钟,粉红色不得完全消失。
六、氨
1、配制标准溶液
纳氏试剂:称取60g氢氧化钾,溶于约250ml无氨水,冷却至室温。另外称取20g碘化钾溶于100ml无氨水,边搅拌边逐步加入二***化***结晶粉末(约10克),至出现朱红色沉淀不易溶解时,改为滴加饱和二***化***溶液,保持搅拌,到出现少量朱红色沉淀不易溶解时,停止滴加饱和二***化***溶液,然后把该溶液缓慢注入上述已冷却的氢氧化钾溶液中,边注入边搅拌,并用无氨水稀释至400ml,然后静置过夜。最后将该溶液上清液至聚乙烯塑料瓶中,常温避光保存。
***化镀溶液:称取分析纯***化钱:,定落至1000ml()容量瓶中,转入试剂瓶中保存,贴标签。
2、分析:取样50ml,加纳氏试剂加1,放置15分钟。如果显色,加***,加无氨水48ml,加纳氏试剂2nd,对照颜色不得更深。(%)
七、重金属
1、配制标准溶液
醋酸盐缓冲溶液:(PH=)称取分析纯醋酸25g,加蒸馆水25ml溶解后,加盐酸液[7mol/L()]38ml,再用盐酸液[2mol/L()](电位计指示)用水稀释至100ml,倒入试剂瓶待用。
硫代乙酰***溶液:称取硫代乙酰***4g,加水溶解成100ml,置冰箱中保存。临用前取混合液[由lmol/L氢氧化钠(氢氧化钠4克+100ml蒸馆水)15ml,