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海南医学院学报
JournalofHainanMedicalUniversity
ISSN1007-1237,CN46-1049/R
《海南医学院学报》网络首发论文
题目:基于生物信息学和体外实验探讨粉防己碱治疗早期矽肺的关键通路
作者:梁超,周家伟,刘亚锋,郭健强,王清森,苏忆欣,邢应如,胡春晓,谢军,
吴静,胡东
DOI:.
网络首发日期:2022-08-18
引用格式:梁超,周家伟,刘亚锋,郭健强,王清森,苏忆欣,邢应如,胡春晓,谢军,
吴静,
通路[J/OL].:///
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发论文视为正式出版。
:.
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基于生物信息学和体外实验探讨粉防己碱治疗早期矽肺的关
键通路
梁超1,周家伟1,刘亚锋1,郭健强1,王清森1,苏忆欣1,邢应如4,胡春晓1,谢军5,吴静1,2,3*,胡东1,2,3*
(,安徽淮南232001;,安徽淮南232001;
净化与职业健康安全安徽省教育厅重点实验室,安徽淮南232001;,安徽合肥230000;5.
安徽理工大学附属肿瘤医院/淮南东方医院集团肿瘤医院,安徽淮南232033)
[摘要]目的:基于生物信息学和体外实验探究粉防己碱治疗早期矽肺发展的关键通路。方法:通过文献挖掘收集矽
肺患者的差异表达基因;利用高通量基因表达数据库(GEO)收集二氧化硅滴注小鼠的差异表达基因;借助在线人类孟德尔
遗传数据库(OMIM)、GeneCards、比较毒物基因组学数据库(CTD)获取矽肺相关的疾病靶点;分别将差异表达基因和疾病
靶点通过R语言及Metascape平台进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;使用
薛定谔(Schrödinger)及Pymol软件进行分子对接及修饰;制备二氧化硅刺激的巨噬细胞和上皮细胞模型,通过PCR技术
和蛋白免疫印迹(WB)验证分析结果。结果:筛选出矽肺病人差异表达基因2065个,滴注二氧化硅小鼠差异表达基因2291
个,矽肺相关疾病靶点803个。GO富集分析主要涉及G蛋白偶联受体结合、调节炎症反应、参与免疫反应等。KEGG通
路富集分析主要包括细胞外基质-受体相互作用(ECM-receptorinteraction)、TNF信号通路、IL-17信号通路等。不同来源
的差异基因和疾病靶点同时筛选出IL-17信号通路。分子对接结果表明矽肺药物粉防己碱与IL-17信号通路中的
RAF/MEK/ERK通路有良好的结合效果。细胞实验表明粉防己碱通过调控RAF/MEK/ERK通路降低巨噬细胞中TNF-α、
TGF-β等炎症因子的表达,同时抑制上皮细胞中上皮间质转化及炎症因子表达。结论:粉防己碱通过RAF/MEK/ERK通路
调控炎症反应和上皮间质转化(EMT)从而影响早期矽肺进展。
[关键词]矽肺;粉防己碱;生物信息学;分子对接;信号通路
Exploringthekeypathwaysoftetrandrineinthe
treatmentofearlysilicosisbasedonbioinformaticsandin
vitroexperiments
[Abstract]Objective:Exploringthekeypathwaysaffectingthedevelopmentofearlysilicosisbasedonbioinformaticsandin
:Collectingdifferentiallyexpressedgenesinsilicosispatientsthroughliteraturemining;Collecting
differentiallyexpressedgenesinsilicondioxideinfusionmicebyusingahigh-throughputgeneexpressiondatabase(GEO);
ObtainingdiseasetargetsrelatedtosilicosisbymeansofonlinehumanMendeliangeneticdatabase(OMIM),GeneCardsand
comparativetoxicgenomicsdatabase(CTD);Differentiallyexpressedgenesanddiseasetargetsweresubjectedtogeneontology(GO)
enrichmentanalysisandKyotoEncyclopediaofGenesandGenome(KEGG)enrichmentanalysisviaR-packageandMetascape
platforms,ö-
stimulatedmacrophagesandepithelialcellsweremodeledandanalyzedbyPCRandwesternblot(WB).Result:2065differentially
expressedgenesinsilicosispatients,2291differentiallyexpressedgenesinmiceinfusedwithsilicondioxide,and803targetsfor
silicosis--coupledreceptorbinding,the
regulationofinflammatoryresponse,
includedECM-receptorinteraction,TNFsignalingpathway,andIL--17signalingpathwaywasscreenedout
fromdifferentgenesanddiseasetargets,indicatingthatIL-17signalingpathwaymightbethekeypathwayforthedevelopmentof
[基金项目]国家自然科学基金项目(81971483);安徽省高校协同创新项目(GXXT-2020-058);安徽理工大学大学生创新
创业项目(2021CX2125,2021CX2126,2021CX2124)
[第一作者]梁超(1999-),男,山西人,硕士研究生,研究方向:主要从事肺部疾病分子治疗。E-mail:
******@。
[通讯作者]吴静(1980-),女,安徽人,教授,主要从事肺部疾病免疫学研究,******@。
[通讯作者]胡东(1980-),男,安徽人,教授,主要从事肺部疾病分子诊疗研究,******@。:.
pathwayintheIL-
factorssuchasIL-6andTGF-βinmacrophagesbyregulatingtheRAF/MEK/ERKpathway,andinhibitedtheepithelial-mesenchymal
:Tetrandrineregulatestheinflammatoryresponse
andepithelial-mesenchymaltransition(EMT)throughtheRAF/MEK/ERKpathwayandthusaffectstheearlyprogressionofsilicosis.
[Keywords]Silicosis;Tetrandrine;Bioinformatics;Moleculardocking;Signalpathway
引言
矽肺是由于吸入二氧化硅或二氧化硅刺激的肺纤维化疾病,是最常见的职业性疾病之一。中国是矽
肺患者最多的国家,平均年确诊病例超过5000例,死亡病例超过20000例。全球矽肺患者中欧洲超过
[1]
300万,美国超过200万。矽肺常与巨噬细胞受体激活、炎症小体有关,二氧化硅被吸入肺后被巨噬细
胞吞噬,巨噬细胞释放炎症因子刺激上皮细胞向间质细胞转化和成纤维细胞的募集,成纤维细胞被刺激
[2,3]
后分化为肌成纤维细胞,产生胶原纤维。已证明二氧化硅可以刺激PI3K蛋白激酶调节自噬体积累从
[4][5]
而促进矽肺发展,也可以通过抑制NF-κB或TGF-β也可以抑制矽肺进程,但人们对早期矽肺的关键
通路并不清楚,没有有效的手段可以进行早期矽肺的识别、诊断和治疗[6],所以对早期矽肺的深入研究有
着重要的临床意义和社会意义。
根据矽肺证型的特点,古代中医学家利用中药以补为法,以通为用,通补兼施治疗矽肺,中药防己
[7]
就是其中之一。防己入药历史悠久,在《神农本草经》《伤寒杂病论》《药性论》等古书中均有记载,防
[7]
己在《神农本草经》中记载味苦性寒,具有治疗风湿水肿、湿疹脉浮的功效。在现代医疗中具有抗肿
瘤,抗风湿性关节炎,保护心血管等作用。研究表明粉防己主要的化学成分是粉防己碱(tetrandrine),为
[7]
喹啉类生物碱,具有抗肿瘤,抗炎、抗纤维化。抗矽肺等药理作用。临床研究表明粉防己碱素治疗矽肺
的临床效果显著,可以改善患者的肺功能水平[8]。同时发现粉防己碱可以减少脂多糖诱导的巨噬细胞的爆
[9]
发,减少氧自由基的产生和肿瘤坏死因子-α(TGF-α)。白介素-6(IL-6)等炎症因子的积累,延缓矽肺
[10]
前期的炎症阶段,减少胶原纤维的产生,改善肺部纤维化形成。本研究基于前期课题组的中药研究成
果,采用矽肺患者基因、二氧化硅滴注小鼠基因和网络药理学三种数据集进行筛选和预测,通过分子对
接和体外实验验证,探究粉防己碱治疗早期矽肺的关键通路,为早期矽肺的治疗提供理论依据。
1资料与方法
矽肺患者的相关芯片数据来源于文献,本研究收集了10名矽肺患者和7名非矽肺患者的肺组织RNA
测序数据进行分析,10名矽肺患者和7名非矽肺患者的肺组织均来自于无锡市人民医院,肺组织在肺移
植时获得,取样时避开了淋巴结和器官,所有参与者都给出书面知情同意书且获得了南京医科大学机构
[11]
审查委员会和中国医学科学院基础医学研究所的批准。二氧化硅滴注大鼠的相关芯片数据来自于GEO
[12]
数据库(theGeneExpressionOmnibus,GEO,/)。在GEO数据库搜索关
键词“矽肺”,经筛选得到芯片原始数据GSE188520以及平台注释文件GPL25290,其中GSE188520中
[13]
样本包括6只普通大鼠和6只二氧化硅滴注大鼠。通过使用limma包对上述芯片数据进行差异化分
析,差异基因的筛选条件为P<,log(foldchange,FC)>1或<-1,将筛选后的基因按照logFC绝对值大小
进行排序,上调和下调排名前一百的基因进行后续分析。
在OMIM数据库[14]、CTD数据库[15]、GeneCard数据库[16]中以“矽肺”为关键词进行检索,运用靶点
[17]
交集可视化工具将交集靶点进行提取构建。
为说明筛选出的关键基因和靶点参与的信号通路和发挥的生物学功能,使用Rstudio软件并利用
R/ggplot2、limma、pheatmap、ggsci、dplyr包对关键差异基因进行了基因本体分析和信号通路富集分析
[18]。
-蛋白质相互作用图
不同基因集筛选出来的通路进行交集得到关键通路,将关键通路相关靶点导入STRING数据库[19],:.
物种设置为“Homesapiens”,保存下载文件为tsv格式,
[20]。
[21][22]
在PDB数据库中关键蛋白的格式化学结构,下载为PDB格式。在PubChem中下载粉防己碱的
化学结构,保存为SDF格式。利用Schrodinger软件中的ProteinPreparationWizard进行蛋白结构优化,
选择保留或删除链、水域和配体等,修复填充丢失的侧链以及进行能量最小化。在ReviewandModify选
项中进行配体、水位置和电荷校正,在Refine选项中进行最后蛋白结构的优化。通过LigPrep进行配体准
备,加氢、去盐、中和带电基团、产生质子化状态最后产生互变异构结构。软件的LigandDocking模块
用于分子对接,通过结合能来评价药物与蛋白结构的亲和力,最后用pymol修饰表现。
用PBS清洗培养皿两遍后,用胰酶消化细胞,根据细胞状态不同选择合适的胰酶消化时间,胰酶消
化后吸取到15ml离心管中,离心5分钟,转速为每分钟5000转,离心后上清液倒掉,用PBS清洗再次
离心5分钟,转速为5000转。倒上清液后加1ml培养液制备细胞悬液,准备计数,将细胞接种到96孔
板,调整细胞浓度在5×103左右,每孔加入培养基100μl,每个样本重复3-5孔,在37度培养箱培养约6
小时后加入不同浓度的药物,放入培养箱24小时后,每孔加入MTS溶液20μl,再次放入培养箱四小时
后测定吸光度值。
-PCR测定细胞炎症因子表达
将细胞样品用PBS洗净加入1mlTrizol,在冰上放置5分钟,
中,加入***仿200μl,震荡混匀静置10分钟。4度12000转离心15分钟,用无RNA酶枪头吸取上清液加
入到500μl异丙醇中震荡静置10分钟,4度12000转离心10分钟收集RNA沉淀,用75%无水乙醇洗涤
后离心五分钟去上清,自然风干后加入适量DEPC水溶解沉淀。随后上机测RNA浓度,各组RNA量调
整到同一水平,配置逆转录体系。逆转录完成后将cDNA、荧光染料和不同引物配置成不同的混合体系上
机。
将细胞样品用PBS洗涤后,根据细胞量的多少,加入还有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液,4度冰箱放
置30分钟后,取细胞混合液离心,去上清取沉淀,测量不同组的细胞浓度并调整到同一浓度。各组蛋白
用8%SDS-PAGE分离蛋白,在冰水中电转80分钟,将蛋白转模至PVDF膜,用BSA封闭液封闭一小时
后与一抗结合,放入4度冰箱过夜,洗膜后与二抗结合60分钟,再次洗膜后上机,最后获得的电泳条带
[23]
图。
实验数据以x±s表示。实验结果使用GraphPadPrism8软件进行统计分析,多组建的比较采用单因
素方差(One-WayANOVA)分析,P<。
2结果
为了揭露矽肺差异基因表达情况,首先分析7正常人和10位矽肺患者的肺实质的单细胞测序情况
[11],共获得2065个差异基因,将数据标准化后根据limma包的分析,分别筛选出上调和下调基因各100
个。其次从GEO数据库中下载表达谱芯片数据GSE188520,其中包括了6只正常小鼠和6只二氧化硅诱
导小鼠,共获得2291个差异基因,通过R包的差异基因筛选,分别筛选出上调和下调基因各100个。最
后利用网络药理学通过Genecards、CTD、OMIM数据库检索,共得到与矽肺疾病相关803个基因,通过
绘制UpSet图,获得交集基因129个,上述基因被认为是与矽肺有密切联系的基因。见图1:.
图1关键矽肺差异基因筛选
注:;;
:.
首先将正常人与矽肺患者的差异基因进行KEGG通路富集分析,以P<,共筛选出13条
KEGG通路,其中细胞外基质-受体相互作用(ECM-receptorinteraction)与纤维化的形成有关。人瘤病毒
感染(Humanpapillomavirusinfection)与细胞周期及凋亡有关,IL-17信号通路(IL-17signalingpathway)
与细胞的生长、分化、炎症等有关。其次将网络药理学数据库的交集基因通路富集后共筛选出166条通
路,主要的信号通路有AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、受体因子相互作用信号
通路等。最后将矽肺大鼠的差异基因进行通路富集后筛选出22条通路,主要有胃酸分泌、IL-17信号通
路、疟疾、阿米巴病等信号通路有关,分析结果表明IL-17信号通路可能是影响矽肺的关键通路。见图
2。
图2差异基因KEGG通路分析
:.
注:;;E二氧化硅滴注大鼠差异
基因通路分析
通过R语言对矽肺患者的差异基因进行GO分析,结果显示共有282个生物过程、33个细胞组分和
35个分子功能。其中主要结果包括纤毛运动、细胞外基质组织、T细胞的活化、参与免疫反应中中性粒
细胞的活化等生物过程,G蛋白偶联受体结合、胶原蛋白结合、生长因子结合、Wnt蛋白结合等分子功
能,活动纤毛、含胶原纤维的细胞外基质、基底膜等细胞组分。其次对网络药理学数据库进行GO分析,
结果显示了2576个生物过程、66个细胞组分和142个分子功能,生物过程包括对脂多糖的反应、细胞对
生物刺激的反应、活性氧代谢过程、调节炎症反应等,分子功能包括细胞因子受体结合、蛋白质丝氨酸/
苏氨酸激酶活性、受体配体活性、G蛋白偶联受体结合等,细胞组分包括囊泡腔、转录调节因子复合物
等,最后对矽肺小鼠的差异基因进行GO分析,包括Toll样受体信号通路、细胞对肿瘤坏死因子反应、
细胞对生物刺激反应等生物过程,糖***聚糖结合、G蛋白偶联受体结合、趋化因子活性等分子功能,细
胞组分与上述两组细胞组分大体相同。见图3。:.
图3差异基因GO富集分析
注:;;E二氧化硅滴注小鼠差异基因
GO分析
PPI网络图中,靶基因用节点表示,靶点之间的连线代表基因之间的相互作用,将最低互动分数设置
为最高置信度。将IL-17信号通路所包含的靶基因导入STRING数据库,按照节点之间的交互分数由高到
低进行排列,分数较高的靶基因大多与MAPK信号通路有关,且这些靶点大多与炎症过程有关,说明IL-
17信号通路中可能起关键作用的是MAPK信号通路,从而促使炎症因子高表达促进矽肺的发展。见图:.
4。
图4IL-17信号通路蛋白互作图
-17signalingpathwayproteininteraction
将IL-17信号通路的关键蛋白与小分子化合物粉防己碱进行分子对接,确定两者结合位置即活性口
袋大小,并显示出小分子和关键蛋白之间氢键作用位置。对接亲和力分数通过薛定谔软件(Schrödinger)
计算得出。分子对接结果表明,粉防己碱与MAPK通路中的关键靶点RAF、ERK之间有良好的结合力。
以上结果间接证明,粉防己碱可能通过调控MAPK信号通路中的RAF/MEK/ERK通路发挥关键作用,从
而对早期矽肺产生影响。见图5。
图5粉防己碱与通路蛋白对接模式图
注:;;
在巨噬细胞系THP-1中,随着药物浓度增加,粉防己碱抑制巨噬细胞增殖的能力逐渐增强,当药物浓
度为5μmol/L时,细胞的凋亡率为20%,当药物浓度为10μmol/L时,细胞的凋亡率为83%,数据显示:.
当加药浓度大于5μmol/L,细胞凋亡率明显增加,不适合用于细胞实验,在巨噬细胞中加药浓度设置为
5μmol/L是最适浓度。在上皮细胞系BEAS-2B中,随着药物浓度的增强,上皮细胞的凋亡率呈线性增
长趋势,在5μmol/L时,细胞的凋亡率为5%,在10μmol/L时,细胞的凋亡率为16%。根据对不同加药
浓度时细胞凋亡率的计算,当加药浓度为20μmol/L时,是效果最佳的浓度。见图6。
图6粉防己碱对巨噬细胞和上皮细胞凋亡的影响(x±s,n=3)
(x±s,n=3)
******
注:与正常组相比,P<,P<。
表1粉防己碱对巨噬细胞和上皮细胞凋亡的影响(x±s,n=3)
(x±s,n=3)
细胞分组凋亡率%(x±s)F值P值
5μmol/±
10μmol/±
<
50μmol/±
100μmol/±
5μmol/±
10μmol/±
<
50μmol/±
100μmol/±
-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α水平的影响
TNF-α主要由巨噬细胞和活化T细胞释放,不但可以刺激其他促纤维因子,还可以刺激TGF-β促进
胶原的形成。IL-1β、IL-1α可诱导吸附炎症细胞,调节其他炎症因子,促进成纤维细胞的增殖。利用
PCR检测加硅组和加药组中炎症因子的表达。与正常组相比,巨噬细胞加硅组的TNF-α、TGF-β、IL-
1β、IL-1α的表达均升高(P<),其中TNF-α和TGF-β的表达显著上升(P<),与加硅组相比,粉
防己碱组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α的表达明显下降(P<),其中TNF-α的表达量下降最为显
著P<),见图7A。与正常组相比,上皮细胞加硅组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α的表达均升高
(P<),其中TNF-α的表达显著上升(P<),与加硅组相比,加药组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、
IL-1α的表达明显下降(P<)。见图7B。
:.
图7各组巨噬细胞和上皮细胞TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α炎症因子的表达情况(x±s,n=3)
-α、TGF-β、IL-1β、IL-1αinmacrophagesandepithelialcells(x±s,n=3)
表2各组巨噬细胞和上皮细胞TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α炎症因子的表达情况(x±s,n=3)
Table2ExpressionofTNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1αinmacrophagesandepithelialcells(x±s,n=3)
细胞指标分组表达量F值P值
C