文档介绍：辽宁中医药大学
博士学位论文
益气活血中药复方治疗CVB<,3>病毒性心肌炎的实验研究
姓名:何伟
申请学位级别:博士
专业:中医内科学
指导教师:张明雪
20090301
摘要研究目的:病毒性心肌炎是指由多种病毒感染引起,以心肌细胞变性、坏死、间质炎性细胞浸润和纤维渗出为主要改变的心肌疾病。其致病病毒以柯萨奇椴《最为主要,而在牧鲅G宸中椭校珻。具有强嗜心性,因此,当前主要针对8腥窘⒉毒性心肌炎模型来开展各项研究,本课题选择病毒性心肌炎作为研究对象的主要原因是,本病自身有很高的危害性,如小儿及***的各个年龄阶段均可累及患病,急性期过后,又有演变为扩张型心肌病的可能性,同时,也可引起小范围爆发流行,而近年病毒性心肌炎的发病率更是呈现上升趋势,因此,针对2《拘孕募⊙椎闹瘟苹蒲芯肯本课题以新生笫筇逋庑募∠赴嘌。感染的P停和ü荧光检测心肌细胞凋亡;免疫组化法检测心肌细胞间缝隙连接蛋白、细胞骨架一肌动蛋白⑿募〖「频鞍譏表达;透射电镜观察P肌炎细胞感染模型心肌细胞功能、形态学改变;激光扫描共聚焦显微镜实时动态检测心肌细胞游离变化及细胞间缝隙连接通讯功能。试图验证益气活血中药复方具有减轻2《拘孕募⊙仔募∠赴庖咚鹕耍灰种菩募∠赴蛲龇⑸坏鹘谙赴谟卫隒浓度;改善细胞间缝隙连接通讯;修复心肌细胞骨架及超微结构的作用,进一步证实益气活血中药复方是治疗2《拘孕募⊙椎挠行Х郊粒嫫钛7ㄊ侵瘟票静〉挠行Х材料与方法:①益气活血中药复方细胞毒性测定:取复苏的细胞,经培养瓶传代后,以每孔接种到孔细胞培养板中,置。%趸寂嘌渲信嘌盚赴实ゲ贴壁生长时,测益气活血中药复方最大无毒剂量。用培养液将益气活血中药复方注射液从原液开始配制成个浓度。每孔,每个浓度设龈纯祝砩个加正常生长液的对照孔。分别于观察细胞生长状态,参考正常对照孔细胞形态,以不引起细胞病变的最大药物稀释浓度为最大无毒浓度。。病毒毒力滴定:于孔培养板中制备单层生长的细胞,弃去培养板中的生长液,以液洗涤各培养孔巍S煤%胎牛血清的维持液,将2《疽詌杜ǘ却邢∈偷絣一,每孔,接种于孔培养板中,每个浓度设龈纯祝砩个正常对照孔,得迫在眉睫。法。辽宁中医药大学二九届博士学住论文
各加维持液甀,置于℃,趸寂嘌渲信嘌直鹩、鄄煜赴病变情况。⑧益气活血中药复方对V滦募∠赴劳龅囊种剖笛:取对数生含病毒培养液,以含ヌヅQG宓奈忠呵崆嵯吹右槐楹螅尤氪右┪镒畲笪薅炯亮起始稀释雠ǘ鹊暮嫫钛V幸└,,置振荡器上振Σ饬扛骺椎奈庵"芤嫫钛V幸└捶,滴加褂ü獯忝鸱馄磷龇馄恚谟ü庀晕⒕迪鹿鄄臁"菀嫫钛中药复方对2《拘孕募⊙仔募∠赴鹀表达的影响:采用免洗。滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育分钟,倾去,勿洗。滴加比例稀释每次。滴加复合物,℃湿盒孵育冲洗危看珼显色,自来水冲洗,苏木素复染,脱水、透明处理,树脂封片,镜下观察。⑥透射电镜电镜检查。⑦荧光漂白恢复检测2《拘孕募⊙仔募∠赴浞煜读油ㄑ豆入适量含、的螅瞎簿劢瓜晕⒕导觳狻"嘁嫫钛V幸└捶蕉訡。病毒长期心肌细胞,每孔加入半数组织感染量浓度2《疚叫募∠赴N另设龅髁憧住S后,每孔加入培养液,再加入芤海放入培养箱继续培养,小心吸弃孔内培养液,每孔加入荡,于酶联免疫检测仪对2《拘孕募⊙仔募∠赴蛲龅挠跋欤赫7掷肱嘌槭笮募∠赴又钟培养板做细胞爬片,笕〉ゲ闾谏ごサ恼W椤⒉《咀椤⒅幸└稍ぷ心肌细胞玻片,以逑次,每孔加入甲醇冰醋酸固定琍冲洗危孔加入染色液痬,避光反应琍冲洗危看疫组化法检测、、泶铮河%:孵育长有细胞的玻片琍冲的一抗,℃温育,逑矗渭由锼鼗梗娣跤。逑次,检测益气活血中药复方对2《拘孕募⊙仔募∠赴⒔峁沟挠跋欤赫E嘌募∠胞螅肏撼逑凑W椤⒉《咀椤⒅幸┳樾募∠赴.%的胰酶消化收集细胞至离心管中,胄膌,弃上清,以%戊二醛固定,送能:于单层贴壁生长达—%的心肌细胞中,加入以、涑痬的应用液,.于℃,E嘌渲斜芄夥跤,取出后春螅性心肌炎心肌细胞游离钙浓度的影响:于共聚焦专用培养皿中正常培养乳鼠心肌细胞,于℃,培养箱中避光负载一钙离子荧光探针琱漂洗后,上共聚焦显微镜检测。益气活血中药复方治疗《拘孕募⊙椎氖笛檠芯畉。￡二
①益气活血中药复方细胞毒性测定:益气活血中药复方最大无毒剂量为/。②2《径玖Φ味ǎ篊。病毒%培养细胞感染量为M。③益气活血中药复方对致心肌细胞死亡的抑制实验法阂嫫钛V幸└捶阶畲笪薅炯亮扛稍。攻击后的心肌细胞时,其吸光度值亦最大,与其它稀释度组比较,差异显著,,证实益气活血中药复方最大无毒剂量具有明显的抑制V滦募∠赴劳鲎饔谩"芤嫫钛V药复方对2《拘孕募⊙仔募∠赴蛲龅挠跋欤赫W樾募∠赴顺试残巍⒙言残危未见凋亡细胞核,而镜下观察病毒组心肌细胞核,呈现出成片的亮蓝色,辆下观察可见细胞核形态不完整,呈碎片状分布,也可见分叶状细胞核。中药组心肌细胞核多呈圆形,未见明显的凋亡