文档介绍：第五节胶体金标记物的制备
胶体金标记蛋白质的原理,一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时,蛋白质呈电中性,此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小,但蛋白质分子的表面张力却最大,处于一种微弱的水化状态,较易吸附于金颗粒的表面,由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面,形成一个蛋白层,阻止了胶体金颗粒的相互接触,而使胶体金处于稳定状态,如果=低于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电荷,胶体金带负电荷,二者极易静电结合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白质等电点时,蛋白质带负电荷,与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀,常用牛血清白蛋白,卵白蛋白,聚乙二醇或明胶作稳定剂。用Sephacryb S—400 (丙烯葡聚糖S—400)层析分离纯化胶体金蛋白标记物只适用于以BSA作稳定剂者。
一、待标记蛋白质的准备
(1)透析除盐:蛋白质溶液内应除去多余的电解质,不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位,影响蛋白质的吸附,因此,标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水( NaCl , )透析。
(2)去除蛋白质中的沉淀:长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体,特别是在浓度高于2mg/ml的情况下,很容易形成聚合物,聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响,因此,标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以100000r/min 4℃离心60min取上清液,调整蛋白质浓度至1mg./ml即可用于标记。
二、胶体金pH值的调整
胶体金与蛋白质的结合成功与否,取决于pH值,一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合,因此,标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。, HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头,因此,一般用精密的pH试纸测定其pH即可。
几种常用的蛋白质标记时胶体金所用的pH值见表5-4。
表5-4 常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值如下
蛋白质
pH
抗体(γ球蛋白)
亲合层析的IgG
单克隆抗体
F(ab')2
SPA(葡萄球菌蛋白)
蓖麻子植物凝血素Ⅰ
蓖麻子植物凝血素Ⅱ
花生凝集素
Helix pomatia lectin
大豆凝集素
Lens Culinaris lectin
Lotus Tetragonolobus lectin
荆豆凝集素
Bandeirae simplicifolia lectin
过氧化物酶
类卵粘蛋白
血浆铜兰蛋白
α-胎球蛋白
小牛血清白蛋白
牛血清白蛋白
牛血球白蛋白结合肽
牛血清白蛋白结合胰岛素
霍乱***
破伤风***
DNAase
RNAase
低密度脂蛋白
α2-巨球蛋白
抗生物素蛋白(亲合素)
链霉抗生物素蛋白
麦胚凝集素
三、待标记蛋白质最适稳定量的测定
(1)光电比色法:制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液(1ml),分别加入5ml胶体金中,迅速混匀,然后,各加入1ml 10% NaCl溶液,摇匀,静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小,OD在520~580nm之间测定,以OD值为纵坐标,蛋白质用量为横坐标作一曲线,取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。。
图5-2 蛋白最适稳定量示意图
(2)目测法:以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例,将标记的蛋白质逐级稀释后(由5μg~45μg另设对照管),各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中,5min后, 10%***化钠,依表5-5顺序进行。
表5-5 具体的做法是按表内进行
管数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
胶体金(ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
蛋白质(μg)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
10%NaCl(ml)