文档介绍：中国农业科学院学位论文计算机辅助分子设计提高蛋白质热稳定性的研究健指导教师:范云六院士申请学位类别:理学博士业:生物化学与分子生物学研究方向:微生物分子生物学与基因工程培养单位:生物技术研究所研究生院文编号:博士研究生:田专提交日期月
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\讹独创性声明研究生签名:\研关于论文使用授权的声明劫,,年占月,埔年石月哆日年虑扇本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定,即:中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名:时间:导师签名:/
\舭乡/纽善矽盔参火/胘‰№中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表吃荔罗笆计算机辅助分子设计提高蛋白质热稳定性的研究微生物分子生物学与田健专业研究方向分子生物学基因工程培养单位芯克⒅行生物技术研究所职称论文题目生物化学与论文作者指导教师汜石/、—‘.口
摘要酶作为天然的生物催化剂,具有高催化效率和高底物选择特异性的特点,在工业生产上拥有巨大的应用潜力和良好的发展前景。但是许多酶分子对工业生产中热处理的耐受性较差,严重制约了它们在工业生产中的应用。因此研究蛋白质的热稳定机制与通过理性设计提高蛋白质的热稳定性一直是计算生物学及蛋白质程领域中的一个研究热点。这对扩大酶的应用范围与探究蛋白质结构和功能的关系均具有重要意义。本研究中我们设计了两个策略分别从微观与宏观两方面分析确定了影响蛋白质热稳定性的关键氨基酸,,利用实验来验证设计策略的有效性。策略一为创新性的将分子动力学模拟应用到蛋白质热稳定性的研究中。其计算步骤主要包括首先利用分子动力学模拟来寻找蛋白质活性中心以外的构象不稳定区段,查找构象不稳定区段内部或其附近的柔性氨基酸绺拾彼,并将这些柔性氨基酸突变为刚性氨基酸绺彼,再利用分子动力学模拟来验证这些突变对构象不稳定区段的影响,即对蛋白质热稳定性的影响。将该策略应用到狾紫韧ü肿佣ρD夥⑾衷诟妹傅牡位氨基酸的构象非常不稳定,并且这些氨基酸不在蛋白质的活性中心,经序列分析发现在该区段的下游存在两个甘氨酸癎,通过同源模建模拟了三个突变体/癎娜维结构,再利用分子动力学模拟来验证这些突变的效果,发现只有突变苊飨蕴岣咔的构象稳定性。将野生型与三个突变体的基因进行表达、蛋白质纯化并测定各自的热稳定性,实验结果与计算结果基本一致,耐咧涤岛分别比野生型提高了。.。热动力学数据分析发现撵时浜鸵吧拖嗟保潇乇浔纫吧透停獗砻髌涫苋却时构象更加稳定。这些实验结果表明该策略是有效的针对蛋白质进行热稳定性改造的分子设计方法。策略二为通过计算突变体和野生型蛋白质解折叠自由能的差值推湔豪啾鹄瓷秆可能会影响蛋白质热稳定性的位点。在本研究中我们设计了新的一个基于蛋白质结构的预测突变对蛋白质热稳定性影响的具体数值:和其正负类别的软件。该软件有两个主要的特征,其一为它可以预测单点与多点突变对蛋白质热稳定性的影响;其二为首次在特征设计的过程中引入了一个蛋白质标准特征,将突变体的结构特征和这个蛋白质标准特征进行比较,而不是直接将突变体的结构特征和野生型蛋白质的结构特征进行比较。用数据集床馐该软件的性能,并将其与一些常用的类似软件进行比较,结果表明该软件无论是分类预测的能力还是回归预测的能力均优于已有的常用软件。我们同样将该策略应用于甇刺岣吒妹傅娜任榷ㄐ圆⒓煅楦貌呗缘挠行浴@玫白质的位点进化熵悖琍姆掷嘣げ饨峁约盎毓樵げ饨峁秆〉娇赡懿挥跋旄妹傅功能但可能会改善其热稳定性的霭被嵛坏恪T谡个位点构建定点饱和突变体库,从中筛选出阳性克隆,再评估突变对蛋白质热稳定性的影响,结果表明有鐾槐涮蹇饩梢陨秆〉玫热稳定性较野生酶提高的突变体。这些实验结果表明利用该策略筛选影响蛋白质热稳定性位点的方法是行之有效的。根据筛选到的鐾槐涮蹇庵械牡サ阃槐湫畔ⅲ卸嗟阕楹贤槐洹W楹贤槐涞牟呗晕O冉