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质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌)、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子(补充:部分质粒为RNA)。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。
有些质粒称为附加体(episome),这类质粒能够整合进真菌的染色体,也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
质粒(plasmid):存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,可在宿主细胞中自主复制,并在细胞分裂时传给子代。
质粒感染细菌后,会赋予宿主细胞一些遗传性状(如对青霉素或重金属的抗性)可作为筛选转化子细菌的根据。
质粒分类:
严紧型(每个细胞1-5个质粒),当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次;
松弛型(每个细胞10-200个质粒)。如果用一定的药物处理还会使质粒拷贝数增至几千份。
一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关,某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型,而在变形杆菌内则属松弛型。
pBR322质粒(4363bp):
主要包括:
①限制性内切酶位点(插入外源基因);
②含有terr、ampr抗药基因,可作为筛选标志。
③含有复制起始点ori(赋予其复制特性)。
四环素抗性基因
(Tetr)失活
(插入失活法)
抗药性标记选择
M13噬菌体:M13mp系列pUC系列
pUC质粒:,编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。
Lac-(突变型宿主细胞):可表达该酶的ω片段.
单独存在的α或ω片段均无活性,只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段,宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性,使特异底物产生蓝色化合物(α-互补)。
α互补的检测
α片段
ω片段
α片段
ω片段
本实验:
大肠杆菌+pEC-ct质粒,
pEC-ct质粒:()
有HindⅢ,BamHⅠ酶切点,可切出CD基因()
3。沉淀悬于200ul溶液I,混匀
↓放置5min
4。加入400ul溶液II,颠倒混匀数十次(20~30次)-1%SDS
↓放置5min
5。加入300ul溶液III,充分混匀(温和操作)
↓10min
沉淀DNA
KAc-HAc
裂解
碱裂解法提取质粒DNA
RNase