文档介绍：实验十一产蛋白酶菌株的筛选
碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶,在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶,具有产酶量高,适合大规模工业生产等优点,被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作,也是学****微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一、基本原理
自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后,其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈,细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大,因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物,用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应,通过分光光度计测定可知酶活大小。
二、实验目的
学****用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法
学****并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法
三、实验器材
从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株
蛋白胨,酵母粉,脱脂奶粉,琼脂,干酪素,三***醋酸,NaOH,Na2CO3,Folin试剂,硼砂,酪氨酸,水等
三角烧瓶,培养皿,吸管,试管,涂布棒,玻璃搅拌棒,水浴锅,分光光度计,培养摇床,高压灭菌锅,尺,玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1. 培养基和试剂的配制
(1)牛奶平板:%的牛奶
(2)发酵培养基:玉米粉4%,黄豆饼粉3%,Na2HPO4 %,KH2PO4 %,3 mol/l NaOH , 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
(3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:;NaOH 4g,溶于1000 ml水中,二液等量混合。
(4)2%酪蛋白:称取2g干酪素, NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液,加热溶解,定容至100ml,4℃冰箱中保存,使用期不超过一周。
2. 酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液,取不同浓度的酪氨酸1mL与5 mL Na2CO3、1 mL Folin试剂混合,40 ℃水浴显色30 min,680 nm测定吸收值并绘制标准曲线,求出观密度为1
是相当的酪氨酸质量( μg ),及K值。
3. 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株(周一下午)
取10g土样混于90mL无菌水中,梯度稀释后涂布到牛奶平板上(稀释梯度:10-3,10-4,10-5,两个平行,每组2块平板),37 ℃培养30h左右观察
建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株
4. 产蛋白酶菌株的观察、划线分离与转接(周三、周四)
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录,量取水解圈与菌落直径,计算其比例,选择比例最大的2株菌。转接到肉汤琼脂平板上进行划线分离(