文档介绍：乙肝病毒核酸检测实验操作流程
广西临床检验中心唐娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
HBV-DNA操作流程

HBV-DNA检测结果分析
临床意义
DNA 提取
PCR 扩增
标本采集
检测原理
HBV :
用一对乙型肝炎病毒特性引物(Primer)和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针,配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种脱氧核苷酸单体(dNTPs)等成分,用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
原理图
每产生一条DNA链,就切断一条探针
每切断一条探针,就产生一个荧光信号
信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升,注入无菌的干燥玻璃管
室温(22~25ºC)放置30~60 分钟血标本使用水平离心机,4000转/分离心5分钟
吸取上层血清,
血
清
的
采
集
血
浆
的
采
集
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升,注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管
立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次,使抗凝剂与静脉血充分混匀
5~10分钟后即可分离出血浆,
注意事项
尽量吸取血清的上层液,有纤维蛋白的标本应离心去除
脂类浑浊标本拒收
(离心4000rpm,5min)
血清
血清
不能使用肝素抗凝
因为对PCR扩增有抑制作用,且很难在核酸提取过程中完全去除
血浆
-DNA的提取
打开HBV-DNA试剂盒
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取出DNA浓缩液、 DNA提取液(置室温融解,充分混匀)
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加入DNA浓缩液和待测样本各100ul(振荡混匀)
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12000rpm,离心10min
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去上清,沉淀中加入20ulDNA提取液(振荡混匀)
(阴、阳性质控品处理方法:各取50ul,分别加入DNA提取液各50ul)
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100℃恒温干浴10min
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12000rpm离心5min
注意事项
。不能用移液器混匀
。离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清,枪头贴管壁顺着液面下移,防止带走不可见的沉淀物。如沉淀不明显可以保留少量液体,建议将移液器量程调至190ul一次性吸取。