文档介绍：周清
一、  基因工程
2、(a)基因工程的原理及技术
原理:基因重组
技术:(一)基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较:
①相同点:都缝合磷酸二酯键。
②区别:E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
(1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
(二)基因工程的基本操作程序
第一步:目的基因的获取
: 主要是编码蛋白质的结构基因。
,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
(1)原理:DNA双链复制
(2)过程:
第一步:加热至90~95℃DNA解链;第二步:冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;第三步:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步:基因表达载体的构建(是基因工程的核心)
:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
:目的基因+启动子+终止子+标记基因
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端。
(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步:将目的基因导入受体细胞_
:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
:
将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。此方法的受体细胞是受精卵或体细胞。
将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞:常用大肠杆菌做受体细胞。
,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步:目的基因的检测和鉴定
,方法是采用 DNA分子杂交技术。
,方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。
;有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
(三)(b)基因工程的应用
:抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。
:提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
:把正常的外源基因导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用。
(四)(a)蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。(基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质)
(1)蛋白质工程崛起的缘由:基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质
(2)蛋白质工程的基本原理:它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构,又称为第二代的基因工程。
基本途径:从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因),以上是蛋白质工程特有的途径