文档介绍：中南民族大学
硕士学位论文
HL-CMS不育候选基因orf216的克隆及稻瘟病抗性基因Pi36的功
能研究
姓名:李丕顺
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:刘学群
20080510
中南民族大学硕士学位论文
摘要
水稻(Oryza sativa L.)是世界最重要的粮食作物之一。上个世纪,以植物细胞
质雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)为基础的“三系”杂交稻的利用使水稻的
产量发生了飞跃的变化。目前,一方面由于世界人口的不断增长和耕地面积的不断
减少,另一方面以病原菌和害虫等生物胁迫引起水稻的减产,使得目前世界的粮食
问题尤为突出。因此,通过对作物品种的遗传改良以提高单位面积产量,将是解决
人类对粮食的需求不断增加这一矛盾的主要途径。
本研究在已有的 HL-CMS 不育相关片段 HL-sp1 分离和克隆基础上,利用
TAIL-PCR 技术进一步扩增其侧翼序列,对 HL-sp1 进行了结构和功能预测分析,并
进行了遗传转化。采用 RNAi 技术以及亚细胞定位技术对稻瘟病抗性基因 Pi36 的功
能进行了初步研究。取得了以下研究结果:
1. HL-sp1 侧翼序列的分析及基因预测
采用单引物 PCR 以及改良的 TAIL-PCR 技术,成功地获得了 HL-sp1 5’端 2009 bp
及 3’端 2555 bp 的序列,将 HL-sp1 延伸至 6740 bp。通过 BLSAT 序列比对,发现
HL-sp1 缺失了线粒体基因 atp6 的 1-1772 bp,而且 5’端近 1700 bp 序列与籼稻 9311
的线粒体序列同源性非常小,而与玉米的 T-CMS 和 C-CMS 线粒体 DNA 序列有部
分的同源性。利用 2 种基因预测软件 RiceGAAS ()和
Softberry 的 FGENESH () 对 HL-sp1 进行了基因预测及注释
分析。结果表明该序列包含 2 个 ORFs。第一个 ORF 全长 171bp,由 4 个不连续的
较短的外显子组成,编码一个功能未知的蛋白;另外一个 ORF 由 651bp 组成,是一
个独立的外显子,编码 216 个氨基酸,暂命名这个候选基因为 orf216,通过与 9311
线粒体序列比对发现,orf216 是由 2 个相差较远的基因的部分编码区和一个未知片
段所组成的嵌合基因。
2. HL-CMS 不育候选基因 orf216 的细胞质特异性及表达分析
以不育候选基因 orf216 的序列设计了特异性引物对水稻 3 种不同 CMS 类型的不
育系、保持系、恢复系及杂交种进行 PCR 分析,证明不育候选基因 orf216 只存在于
I
HL-CMS 不育候选基因 orf216 的克隆与稻瘟病抗性基因 Pi36 的功能研究
具有红莲型不育胞质的品种中。进一步利用反转录 PCR 对不育候选基因 orf216 进行
了表达模式分析,初步结果表明该基因为组成型表达。
3. HL-CMS 相关不育候选基因 orf216 的克隆与遗传转化
利用已经克隆的 BT 型水稻育性恢复基因 Rf1b 的线粒体定位信号肽序列和双元
载体转化体系 ,成功地构建了重组植物表达载体。以与红莲型不育
系粤泰 A(YTA)同核异质的保持系粤泰 B(YTB)作为受体,通过农杆菌介导的
遗传转化体系进行了候选基因的遗传转化,获得了一定数量的转化植株。对 T0 代转
化植株进行了选择标记潮霉素基因和目的基因的 PCR 分子检测。结果表明候选基因
成功地插入受体品种的基因组中。
4. 稻瘟病抗性基因 Pi36 RNAi 干涉载体的构建与遗传转化
利用植物干涉表达载体 pCAMBIA1300RS 成功地构建了 Pi36 的 5’端、3’端和
NBS 保守结构域的 3 个植物 RNA 干涉表达载体,分别将这些重组载体转化至农杆
菌菌株 EHA105 后,对水稻抗病品种 Q61 进行遗传转化。经过分子鉴定后,获得了
一批阳性转化植株。荧光定量 PCR 分析表明,3 个干涉载体的转化植株中目的基因
Pi36 的表达量均有不同程度的下降,其中以 ORF 5’端的片段构建的载体干涉程度最
强。
5. 稻瘟病抗性基因 Pi36 亚细胞定位载体的构建与遗传转化
将 Pi36 ORF 1-1827 bp 的序列通过 NcoI和 BglII酶切位点插入植物表达载体
pCAMBIA1302,在 35S 强启动子的控制下在洋葱表皮细胞进行瞬时表达,