文档介绍：专业: 农业资源与环境
姓名: 李佳怡
学号: 3130100246
日期:
地点: 生物实验中心310
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实验报告
课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年成绩:__________________
实验名称: 质粒DNA的微量制备及电泳检测同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛
一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填)
三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填)
五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理
七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得
一、实验目的和要求
1、学****并掌握质粒DNA的提取原理和方法;
2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作;
3、学****并掌握对电泳检测结果的初步分析。
二、实验内容和原理
1、实验内容
①质粒DNA的提取
②DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定
实验原理
①质粒:
质粒是一种染色体(核质体)外的寄生性的自主复制子,存在于细菌等细胞中,为双链闭环的DNA分子,大小在1-200kb之间,具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌***等细胞非必需的遗传信息,但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞(细菌)基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移,因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。
②从细菌细胞中抽提质粒DNA的步骤:
a细菌培养使质粒大量扩增;
b收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ;
c进一步除去蛋白、脂类、RNA等杂质,分离和纯化质粒DNA。
③碱裂解法来分离纯化质粒DNA:
在EDTA存在下,经过SDS处理使细胞膜裂解,从而使菌体充分裂解,利用在碱性条件下(NaOH),使核质体DNA与质粒DNA的变性;加入乙酸钾,在中性条件下,核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异,质粒DNA很快得以复性,而细菌核质体DNA分子难以复性,核质体DNA会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来,质粒DNA则留在上清液内;上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等,可通过碱性酚-***仿-异戊醇混合液的抽提去除;含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀,这是由于当加入无水乙醇时,其会夺去核酸周围的水分子,使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。
④DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:
DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中()带负电荷,它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即具有不同的相对分子量的DN***段泳动速度不同,并能区分出不同的区带。DN***断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(EB)染色后,在紫外光下可见橙红色带,并可确定DN***断在凝胶中的位置。
⑤影响DNA泳动速率(迁移率)的因素有:
DNA分子质量的影响:双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大,迁移率越小。
DNA构型的影响:超螺旋DNA>线状DNA>开环DNA。
胶浓度的影响: 浓度越低,相同核酸分子迁移越快,一般常用的凝胶浓度为1%~2%;
电场强度的影响:电