文档介绍：该【相差显微镜 】是由【飞行的大山】上传分享，文档一共【12】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【相差显微镜 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。相差显微镜
、实验目的
掌握相差显微镜的原理,构造及其使用方法。
二、器材与试剂一般复式显微镜,相差显微镜附件:相差物镜、转盘聚光器、调中合
轴望远
镜和绿色滤色镜、载片、盖片、滤纸、活体生物样品等。
三、实验原理在显微镜下镜检时,视场中的样品只有在反射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质
有变化时,方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明,照明光辉经过这种物体时,透过或反射光的波长和
振幅都不发生改变,因此用一般光学显微镜难以辨清活体的构造。必定借助于固定和染色等理化方法,使样
品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化,即在颜色和亮度上有所差别,以供鉴别。
相差方法应用于生物学上的主要价值,在于它能对透明的活体进行直接观察,无需采用使细胞致死的固
定和染色的方法。染色合活体以有害的影响,甚至失真。由此,才使相差法显得异常重要。
。相位是指在某一时间上,
光的颠簸所达到的地址。
一般由于被检物体(如不染色的细胞)
所能产生的相差的差别太小,
我们的眼睛是很难分辨出这种差
其余。只有在变相差为振幅差(明暗之差)此后,才能被分辨。
当光波经过两种折射率不相同的物质时,如空气T水,或由空气T玻璃,其波长、振幅和
相位皆有不相同的变化。比方:光波分别经过1cm厚的水和1cm厚的玻璃时,由于两者折射率不相同,经过它们
的光波在相位上产生必然的差别。经过玻璃的光波相位落后,由于玻璃的密度和折射率比水大。因此,光波的波长和频率都小于水。
相差决定于光波所经过介质的折射率之差及其厚度,等于折射率与厚度的乘积之差(即光程之差),介质越厚或折射率越大,光波减速也越大。
相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。
,只要利用衍射和干涉现象,把相差变成明暗的振幅差,即可能看
到。
(1)衍射
波在同一均匀媒质里流传是沿直线方向进行的,若是在它流传的方向上,遇到迎面挡住的孔或阻挡物不比它的波长大得多,这时波就会明显的绕到阻挡物后边或孔的外面去(流传路线发生了波折),这种现象叫
波的衍射。
光也有衍射。光经过大小同光的波长的相差不大的微小物体时,也要发生衍射。
(2)干涉
在同一种媒质里流传的两列波,若是它们的频率和波长相同,在两列波订交的地域里,由于叠加的结果,
每一点的合振幅都是必然的,并且出现振动加强和振动减弱,这就是波的
干涉。
光也发生干涉。光波经过小颗粒的物体后产生直射光(
S)和衍射光(
D),衍射光的光
波振幅小,相位滞后。在光学系统中,这种直射光和衍射光相遇或光的叠加,振幅发生变化,
光辉或明或暗,就是光的干涉现象。
若是物体粒子是折射率稍大于周围媒质的极小的透明体时,由于光程(折射率和厚度的
乘积)比较大,因此经过粒子的光比周围的光在相位上有所推迟。这是由于被检粒子的衍射
光相位比直射光相位大体迟1/4波长的缘故。若是在直射光的经过点和大部分的衍射光的通
过面放置吸取光的物质或推迟相位的物质时,就能分别改变直射光和衍射光的相位和振幅。
若是把直射光相位推迟1/4波长,使之与衍射光保持同一相位,合成波(P)等于直射
光与衍射光振幅之和,即P=S+D,振幅加大,亮度提升。相反地,把衍射光相位推迟1/4
波长,两者的相差变成1/2波长,合成波的振幅等于两波的振幅差,即P=S-D,这时亮度要
减弱、变暗。光辉的相位肉眼是看不到的,但是利用衍射和干涉的现象把相位差变成振幅差
(明暗反差)就能用肉眼鉴别。图1-2表示直射光(S细线)和衍射光(D虚线)干涉的现
象。D的相位比S被推迟1/4波长。合成波(P粗线)由S与D两者干涉而生成,形成被检物体的像,振幅与
S相同,相位稍推迟。
图1-2直射光和衍射光的干涉
S:细线,直射光;D:虚线,衍射光;P:粗线,合成波
相板的作用
为了达到相差效应,在相差显微镜的物镜中,装有由光学玻璃制成的相板(phaseplate)。在圆形相的
平面上,有一圈与周围(里外)相板厚度不相同的或凸凹的圆环。其构造如图1-3。相板分两部分:
(1)共轭面(conjugatearea):平时为环状,是经过直射光的部分。其环是突出的,也可能是凹
陷的。
(2)补偿面(complemetaryarea):共轭面内外两侧部分,是经过衍射光的部分。
在相板的共轭面或补偿面上,涂有改变光波相位或吸取光辉的物质。当光辉经过时,使
光波的相位或振幅改变,从而达到不相同的目的与观察收效。利用相板把光波相位推迟,振幅
改变。相板的作用,除推迟直射光和衍射光的相位之外,还有吸取光,从而使亮度改变的作
用。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上,因此,相板也安装在透镜中间。
图
1-3
相板的种类及构造
左上:吸取直射光的明反差相板平面和剖面图;
左下:吸取直射光的喑反差相板剖面图;
右上:吸取衍
射光的明反差相板平面和剖面图;
右下:吸取衍射光的暗反差相板剖面图;
黑色:吸取光辉层;浅色:
推迟相位层;白色:玻璃。
相板的种类比很多,对光的吸取率高低不相同,因此产生不相同的反差收效,从反差上大体可分以下两类(图
?ryvvrwv
1-4):
图1-4明反差与暗反差
左:明反差,直射光(
S)与衍射光(
D)相位相同,两波干涉结果合成波
P=S+D
,振幅加大;
右:暗反
差,直射光与衍射光相位相差
1/2
波长,两波干涉结果合成波
P=S-D
,振幅变小。
(1)
明反差(brightcontrast
S-0
):是指在相差显微镜的视场
)或负反差(negativecontrast
中,物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于媒质时,
一
射光被相板的共轭面
(由于在共轭面上涂有改变相位和吸取光辉的物质)推迟
1/4波长,同时吸取80%~90%,
振幅变小,致使仅由直射光照射的背景变暗。
经过补偿面的衍射没有变化,
由于直射光推迟
1/4波长,两者(直射光与衍射光)有完好相同的相位,合成波
P等于直射光S与衍射光D
之合,即P=S+D,故振幅加大。物像是这两种波的合成波造成,即物像等于
P。因此比只有
直射光照射的背景亮得多。
(2)
暗反差(darkcontrast
)或正反差(positivecontrast
):是指在相差显微镜的视场中,
背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反,把经过补偿面(由于在相板的补偿面上涂有
改变光波相位的物
质)的衍射光推迟
1/4
波长,使衍射光与直射光的相位相差
1/2波长,同
时,直射光在共轭面(上涂吸光物质)被部分吸取。由于两者在像点互相干涉的结果,使合
成波(P=S-D)振幅变小,被检物像的影像比背景明显变暗。
依照上述原理所制成的显微镜即是相差显微镜,聚光镜下面装有环状光阑,物镜后焦面装有相板。
相差显微镜的光路与成像
相并显微镜的照明光束,
由转盘齐聚器环状光阑的环状孔射入聚光镜,
透射载物台上的
被检样品,经样品后,入射光除透射的直线光外,同时产生衍射光。衍射光的振幅较小,相
位滞后。直射光和
衍射光进入物镜,前者由环状的共轭面、后者由较大的补偿面透过相板,
前互相干涉造像。样品的影像由直射
光(
S)和衍射光(D)经干涉后的合成波(P)造成,
即
P=S
;背景仅由直射光形成。由于直射光和衍射光两种光波的相位差别不相同造成不相同
的反差收效,或明反
±D
差或暗反差不等视所用物镜的相板种类而定。
成像光束由物镜射入目镜,
在目镜的视场光阑处再次放大,并由出射光瞳射出目镜。
5
、装置
相差显微镜不相同于一般光学显微镜,
在装置上有四种必不能缺的部件:
相差物镜、拥有
环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。
(1)
相差物镜(phasecontrastobjective
)
相差物镜是显微镜特有的重要装置。
在相差特镜内的后焦面上装有种类不相同的相板。
相
板由于前述的作用,
造成视场中被检样品影像与背景不相同的明暗反差,
各具不相同的收效。因
物镜内相板种类或构成的不相同,物镜在明暗反差上可区分为两大类,即明反差(
B)或负反
差(N)物镜和暗反差(D)或正反差(P)物镜。物镜的反差种类,用英文字母
B或N或
D或P标志在物镜外壳上,并兼有高
H(High
)、中M(Medium
)和低L(Low)等三种不相同
的反差。有的相差物镜用
ph字样的标示。
同一反差类其余物镜,依放大率的不相同,又可分为
10X、20X、X40、和100X数种,因
此,相关物镜种类颇多,一套可多达
20余种。
相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜(
PL)。
(2)
转盘聚光器(turretcondenser)
位于镜台之下,一般聚光器的所在地址上,由聚光镜和环状光阑(
annulardiapheragm
)
构成。环状光阑位于聚光镜之下,是一种特其余光阑装置,由大小不相同的环状通光孔构成,
不相同规格的通光孔
一一环状光阑装置在一个可旋转的转盘上,按需要调转使用(图
1-5
)。
环状光阑的环宽与直径各不相同,
与不相同放大率的相差物镜内的相板相般配,
不能滥用。转
盘前端朝向使用者一面有标示窗(孔)
,转盘上的不相同部位标有
0、1、2、3
和4或0、10、
20、40和100
字样,经过标示窗显现。
“0”表示非相差的明视场的一般光阑。
1或10、2
图1-5转盘聚光器的构造
或20、3或40和4或100,表示与相应放大率的相差物镜相般配的不相同规格的环状光阑的标志。经过手动转
入的标示窗内之数字,表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。
(3)合轴调中望远镜(
centeringtelescope
)
合轴调中望远镜简称CT,又名合轴调中目镜。它是眼透镜,可行起落调治,拥有较长的焦距的一种望远
目镜。镜筒较长,其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为环状光阑的环孔(亮环)与相差物镜相板的共轭
面环孔(暗环)的调中合轴与调焦之用。相差显微镜使用时,转盘聚光器的环状光阑与相差目镜必定般配,且
环状光阑的孔环与相差物镜相板共轭面的环孔在光路中要正确合轴,并完好切合或重叠。以保证直射光和衍
射光各行其路,使成像光辉的相位差转变成可见的振幅差。但是,镜体的光路中前述两环的影像较小,一般
目镜难以辨清,不能够进行调焦与合轴的操作,非借助合轴调中望远镜不能。
(4)绿色滤色镜(greenfilter)相差物镜的种类,从色差除掉情况来分,多属消色差物镜(achromatic
objective)或PL物镜。消色差物镜的最正确清清楚范围的光谱区为510~630nm。欲提升相差显微镜的性
能最
好以波长范围小的单色光照明,即接物镜最正确清楚范围的波长的光辉进行照明。
相差物镜时,在光路上加用透射光辉波长为500~600nm左右的绿色滤色镜,使照明光辉中
收,只透过绿光,可提升物镜的分辨能力。该滤色镜兼有吸热的作用,以利活体观察。
因此,使用
的红光和蓝光被吸
四、实验步骤
相差显微镜的使用,较之一般显微镜术要复杂些,但亦易于掌握,按以下过程进行操作。如前所述,相
差显微镜差别于一般光学显微镜的装置主要有相差物镜、转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色滤色镜四种部
件。使用时将这些部件调换安装在同型号的一般光学显微镜上,即成为相差显微镜。
,旋入相差物镜,与一般目镜配套使用。
,把一般明视场聚光器至最低位,旋松固紧螺丝,卸掉
聚光器。把转盘聚光器布置到相应地址上,旋紧固紧螺丝,转动聚光器起落螺旋,使聚光器升至最高地址。
转盘聚光器的标示孔,朝向操作者。此时,转盘聚光器上面的聚光镜部分,进入光路;下面的环状光阑转盘,
可视需要转动使用,把与物镜般配的环孔旋入光路,使之处于转盘聚光镜下。
。
转盘聚光器调换安装后,要进行合轴调中,使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合一。其步聚以下:
1)把转盘聚光器的环状光阑调至“0”位,明视场照明的一般可变光阑进入光路。
2)旋转聚光器起落螺旋,聚光器升至最高位。
(3)接通照明光源,使视场光明。
(4)把被检样品放到载物台上,用低倍(4X)物镜聚焦。
5)减小镜座上的视场光阑开孔,至最小。
6)从目镜观察,在暗视场中可见一减小的、光明的、多角形的视场光阑图像。
(7)转动转盘聚光器的两个调中杆,推动聚光器,把视场中的光明的多角形的视场光阑图像,调至视场
中央。
(8)开放视场光阑至视场同大,视两者周边可否完好重合;否则,复用调中螺杆,使聚光器精神调中。
。按物镜放大率与反差收效的不相同,
相板圆环(共轭面)的大小与构造亦不相同。转盘聚光器的环状光阑为一系列的透光的,不相同大小的光明环孔,
与不相同放大率的物镜相应。使用时严格般配,当物镜改换时,环状光阑亦作相应的改换或调整。
在视场中观察所见,环状光阑为一光明的圆环,而相板的圆环为一暗环。互相般配的明环与暗环大小
一致。在使用时两者要合轴,互相重叠。两环的重叠,须经过合轴调治方能获得。其方法以下:
(1)相差物镜与环状光阑的般配:正确地般配取决于所用物镜放大率。比方,当使用
X相差物镜时,环状光阑转向ph3或40位,使相应地环状光阑进入光路。
20>PM=40
100>PL=100
40>NH=40
40>NM=40
100>NL=100
20>PH=20
(2)把CT放入目镜筒:从目镜筒取出一个目镜,换入调中合轴望远镜(CT)。CT为
一眼透镜,也是可行起落调治的望远目镜,专为观察视场中明环与暗环图像之用。由于用一般目镜看不见两
环的清楚图像。CT在使用前眼透镜应处于最低位,即CT为最短小的状态。
(3)明环与暗环的聚焦:一手固定位于目镜筒中的CT镜筒,使其透镜地址不能够上移,另一手逆时针
转到CT上部可调的眼透镜部分。转动的同时,经过CT向现场中观察,即国旋转边观察初始,两环可能为模
糊的图像,连续转动CT目镜可调部分至清楚地窥见明环与暗环止。
(4)明环与暗环的调中重叠:相板的暗环是固定不动的,处于光路之中,暗环的中心,即显微镜
光轴的中心。环状光阑的亮环可调治搬动。转盘聚光器环状光阑的地址,因聚光器的可调其中心地址,经常
偏离光轴轴心,需调整,使其归中。环状光阑的调中装置或部件,
因厂家或型号的不相同而有别。如OLYMPUSBH2-PC型相差显微镜,环状光阑调中装置为位于转盘聚光器两侧
的两个伸丝自如的调中螺杆,用以控制改换环状光阑的方向,达到调中;而NikonFIVORPHOT型显微镜的相
差装置,其环状光阑的调中部件为位于转盘聚光器表面,可向任一方向滑动的环状钮。调中时,手指调中装
置,搬动明环,使之与暗环合一。在两环调中过程,向来在经过CT的观察下进行。
在调治过程中,如亮环比暗环小,并位于暗环内侧时,应降低聚光器地址,使亮环放大。若亮环大于
暗环时,应提升聚光器,使亮环减小。如聚光器已升至最极点还不能够完好重合,可能是载玻片过厚之故。
(5)回装观察目镜:待相差物镜的暗环与环状光阑的亮环调中、重叠后,从目镜筒中取出CT,放
回观察用的接目镜,以便镜检观察。
、不相同反差种类和反差程度之分。相差物镜的反差种类和反差
程度以及放大倍数,皆用英文字母和数字标示在物镜壳中。比方:
倍,正反差,反差程度高。
倍,正反差,反差程度中等。
倍,正反差,反差程度低。
倍,负反差,反差程度高。
倍,负反差,反差程度中等。
倍,负反差,反差程度低。
100>DH=100倍,暗反差,反差程度咼。
40>DM=40倍,暗反差,反差程度中等。
20>DL=20倍,暗反差,反差程度低。
10>BH=10倍,明反差,反差程度高。
20>BM=20倍,明反差,反差程度中等。