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惯例病毒学实验技术
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老例病毒学实验技术
(一)病毒的培养
实验动物:家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠
主要用于:
①分别病毒,并借助传染范围试验判断病毒
②培养病毒,制造抗原和疫苗
③测定各毒株之间的抗原关系,(用实验动物作中和试验和交叉保护实验)
④制备免疫血清和单克隆抗体
⑤作病毒传染的实验研究,包括病毒毒力测定、成立病毒病动物模型等
注意:选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系,以及合适的接种路子和剂量。
鸡胚
(一)条件要求
SPF鸡、孵化温度38-39℃,湿度40-70%,通风。新鲜受精卵:产下后不高出10天并
保存10℃左右。
(二)优点
组织分化程度低,可选择不相同的日龄和接种路子,病毒易于增殖,传生病毒的组织和液体中含有大量病毒,简单收集和办理,而且根源充分,设施和操作简略易行。
(三)接种路子
(10-12日龄鸡胚)
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分别和增殖。
1)方法一(造人工气室)
①
在胚胎周边近气室处,选择血管较少的部位,用电烙器在卵壳上烙一个直径约
3-4mm的
烤焦圈。
②
用碘酊和酒精消毒后,小心用刀尖撬起卵壳,造成卵窗。
③
在气室端中央钻一个小孔。
④
用针尖挑破卵窗中心的壳膜,切勿伤害其下的绒毛尿囊膜。
⑤
滴加滴生理盐水于刺***,用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气,造成气室内负压,
使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形***工气室,
此时可见滴于壳膜上的生理盐水快速渗
入。
⑥
用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦
用透明胶纸封住卵窗,或用玻璃纸盖于卵窗中,周围涂上消融的白腊密封,气室中央的
小孔用白腊密封。
⑧
鸡胚横卧于卵箱中,禁止翻动,保持卵窗向上。
2)方法二
①
在气室端的卵壳上开约
×。
②
用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③
滴入接种物。
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④
用透明胶纸关闭张口。
(10-11日龄)
用于正粘病毒和副粘病毒(
NDV)
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1)画出气室和胚位
2)在气室凑近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒
3)用钢锥穿一小孔
4)-1cm,注入接种物
5)用白腊封口,置孵卵箱中孵育,每天翻卵1-2次
(6-8日龄)
主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分别和增殖。
1)画出气室和胚位
2)垂直放置在卵座上,用碘酊和酒精消毒气室外端
3)以钢锥在气室中央锥一小孔
4)将注射器针头沿此小孔插入3cm,注入接种物
5)用白腊封口,置孵卵箱中孵育,每天翻卵1-2次
羊膜腔接种,正粘病毒和副粘病毒
静脉接种,蓝舌病毒
脑内接种,狂犬病毒
组织培养
原代细胞:应用胰酶均分别剂将动物组织消化成单个细胞悬液,合适冲洗今后,加入营养液,
平常即可使其贴附于玻璃壁上,并生长增殖。
继代细胞:将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。
传代细胞:由于遗传突变也许在理化学物质和致瘤病毒的作用下,组织培养细胞中有时出现
恶性变细胞,也就是癌变细胞,这种病变细胞拥有很高的增殖势能,而且几乎
能够无量地传代。
原代细胞培养(以鸡胚成纤维细胞为例)
1)在无菌条件下采用
9-10日龄鸡胚,置灭菌平皿中,除去头(或仅除去喙和眼)
、爪和内
脏,并剪成块。
2)用Hanks液,充分冲刷后移入大号青霉素瓶或其他广口瓶中,
用眼科剪剪成
3
1mm大小的
碎块。
3)加入Hanks液,充分冲刷,并静置几分钟,待组织块下沉,吸弃上层液体,再加洗液。
这样屡次冲刷2-3遍。
4)%胰酶,并调整pH至,振荡混匀后置37℃
水浴中感作30分钟,每10分钟轻轻摇动一次。
5)取出,小心吸弃上层胰酶溶液,用洗液轻洗2次后,用大口径吸管屡次吹打,使细胞游
离。
6)用双层或三层纱布过滤,收集滤液于离心管中,以600rpm离心积淀5-10min,吸弃上清
液,按每个鸡胚5ml的量,加入营养液,并用吸管屡次吹打,直至形成均匀的细胞悬液。
7)细胞计数(培养时,使细胞达到5×105个/ml)
+%结晶紫——构椽酸()溶液,室温或37℃温箱中
5-10分钟,充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数(N)。每ml悬液中的细胞数(n)=N/4×10000×K(稀释倍数)。
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传代细胞系培养
优点:1)能够无量的传代。
很多细胞系对病毒很敏感。
某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养,合适病毒抗原的大量生产。
生长旺盛,生殖快速,对营养条件不苛刻。缺点:在传代过程中碰到支原体和病毒的污染。
细胞分别剂
,致使细胞
间质水解而使细胞或组织块消化为分其他单个细胞。
***四乙酸二钠(EDTA)
营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、协助生长因子。
1)动物血清中含有细胞生长所必定的各样营养因子。
2)促使细胞的贴壁和生长。
3)拥有很强的酸碱缓冲作用。
(二)病毒传染力的滴定
LD50,EID50,TCID50
TCID50的测定)
10倍的稀释,从10-1—10-10。
96孔微量培养板中,每一稀释度作
8孔,每孔接种100ul。
100ul,使细胞量达到
3×10
5个/ml。
,正常细胞比较作两纵排。
,一般需要察看5-7天。
,按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID50的计算方法:
-Muench法
病毒液
出现
不出现CPE孔
累计
出CPE的孔
CPE孔
不出现CPE孔
所占的%
稀释度
出现CPE孔
10-1
8
0
27
0
100(27/27)
10-2
8
0
19
0
100(19/19)
10-3
7
1
11
1
(11/12)
10-4
3
5
4
6
40(4/10)
10-5
1
7
1
13
(1/13)
10-6
0
8
0
21
0(0/21)
高于50%的百分数-50%-50
距离比率===
高于50%的百分数-低于50%-40
lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
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=×(-1)+(-3)=-
TCID50=10-
病毒液稀释度
出现CPE孔的比率
10-1
8/8=1
10-2
8/8=1
10-3
7/8=
10-4
3/8=
10-5
1/8=
-6
0/8=0
10
lgTCID50=L-d(s-)
最高稀释度的对数
D:稀释度对数之间的差
S:阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-(-1)×(-)
=-
TCID50=10-
(三)病毒中和试验
一、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合,使后者丧失传染能力。
二、用途
。
病毒分别株的判断。
不相同病毒株的抗原关系研究。
疫苗免疫原性的谈论。
免疫血清的质量谈论。
测定实验动物血清中可否存在抗体等。
三、分类
(一)终点法中和试验
固定病毒——稀释血清法。
将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
2)
在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释(详细方法是在
96孔板中先加入50ul生
长液,再加50ul
待检血清,混匀后,吸
50ul至下一孔,这样下去。向到达
1:256),每
个稀释度作4孔。
3)
在上述各孔内加入
50ul稀释好的病毒液,混匀后放入
37℃5%CO2培养箱中作用
45min-60min。
同时设待检血清毒性比较,阴、阳性血清比较,病毒比较和正常细胞比较。
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感作完成后每孔加入100ul细胞悬液,放37℃5%CO2培养箱培养,每天察看并记录结果。
结果计算,按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
Reed-Muench计算方法:
血清稀释度
CPE孔数
无CPE孔数
累
计
CPE孔数
无CPE孔数
保护率(%)
1:4(10-)
0
4
0
9
100
1:16(10
-
)
1
3
1
5
83
1:64(10-
)
2
2
3
2
40
1:256(10-)
4
0
7
0
0
1:1024(10-)
4
0
11
0
0
高于50%的保护率-50%
距离比率=
高于50%的保护率—低于50%的保护率
83-50
=
83-40
高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比率×稀释系数的对数
=-+×(-)
=-
-=1/46
即:1:46稀释的待检血清可保护
50%的组织培养细胞免于出现
CPE。
2.
固定血清——稀释病毒法。
1)
将病毒作连续10倍稀释
1)将稀释好的病毒接种96孔板,每个稀释度接种一纵排共
8孔,每孔
50μl,做两块板
子,在一块板子的每孔加入
50μl待检血清(试验组),另一块板子的每孔加入
50μl正
常血清(比较组),混淆后置
37℃5%CO培养箱作用1h。
2
2)尔后在每孔中加入100μl细胞。
3)其他还设两纵排正常细胞比较。
4)置37℃5%CO2培养箱培养,每天察看并记录结果。
5)分别计算每组病毒的TCID50,尔后计算血清的中和指数。
试验组TCID50
中和指数=
比较组TCID50
(二)蚀斑(痘斑)减数试验
1、蚀斑技术
病毒蚀斑:又称空斑,指病毒在已长成的单层细胞上形成的限制性病灶。
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原理:将病毒悬液作连续的10倍稀释,随后各取定量,接种于已经长成单层的敏感细胞上,
并覆盖中性红琼脂糖,待其出现蚀斑后计数,即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑
单位。
用途:①用于病毒纯化;②测定病毒悬液中传生病毒的含量。
2、蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混淆物以及病毒——待检血清混淆物分别接种到单层细胞上,随
后覆盖营养琼脂或***纤维素,进行蚀斑测定,比较病毒——正常血清组和病毒——待检
血清组产生的蚀斑数,两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比比较组
减少50%作为判断依照,血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(三)交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫,尔后以待检病毒进行攻击,依照实验动物被保
护的情况,判断待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长,而且需要大量的实验动物。
用途:(1)应用已知V判断未知V
2)应用已知免疫血清判断未知V
3)应用已知V判断未知血清
(四)病毒的分别和判断
病毒资料的注备
、肝、肌肉等器官或组织
充分研磨后加入5倍量的Hank’s液()屡次冻融三次。2000rpm10min,
取上清作接种物。
、乳汁、脓汁均分泌物或溢出物
用内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液,将其稀释3-5倍,充分混匀悬浮后,置4℃
冰箱内感作2-4h或留宿,200rpm10min取上清作接种物。
仔细用棉拭子擦拭咽喉部,并快速将其泡入盛有2-5mlHank’s液的(200-500u/)
试管内,充分涮洗棉拭子,屡次冻融3-5次,收集液体部分,2000rpm10min,收集上清作
接种物。
用含100u/’s液作10-20倍稀释,4℃感作4h,2000rpm10min取上清作接种物。
直接接种用。
接种方法
当前常用鸡胚分其他病毒有正粘V、副粘V、痘V、脑炎V及引起禽类疫病的其他好多V。
。
病毒增殖的判断
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(CPE)
乙型脑炎V脊髓灰质炎V
流感V西方马脑炎V
猪传染胃肠炎牛病毒性膜炎粘膜病V
病毒传染力的滴定
LD50、EID50、TCID50
病毒理化学特点的测定
(药物控制试验)
FUDR、IVDR、BRUDR
原理:FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物,进入cell后发生磷酸化,掺入新合成的DNA
以代替胸腺嘧啶产生至功能分子,进而控制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。
1)***敏感试验
取同批病毒分装于两个青霉素瓶中,每瓶16ml,在其中1瓶加入麻醉用***,使终浓
度为20%,两瓶均用橡皮塞塞紧后,置4℃冻箱内作用24h,此间时时振荡,随后以2000rpm离心20min。已加***的小瓶,用毛细吸管吸取病毒液,移入另一小瓶内,合适吹打,使残
余***挥发殆尽,尔后滴定两组病毒的TCID50。
2)***仿敏感性试验
向病毒液内加入分析纯***仿,%,置4℃振荡混淆10min。随后500rpm
5min,尔后吸取上层液体,滴定病毒TCID50。%的生理盐水,同
样办理和滴定。
脊髓灰质炎V、猪传染性胃肠炎V对胰酶有较强的抵挡力,痘V、呼肠孤V、疱疹V易
被胰酶灭活。取病毒液两瓶,每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml1%的trypsin,%,
另一瓶加入1ml1640(培养基),用橡皮塞塞紧瓶口,将小瓶倒转几次,使其充分混淆,置
37℃1h,随即加入灭活犊牛血清8ml,充分混淆,停止胰酶的作用。最后滴定两瓶V的TCID50。
取等量病毒液两瓶,(),
并在另一个小瓶内加入相同于用酸量的培养基作为比较,置37℃水溶或室温中感作2h(or
1h),%,比较组再加紧入相同于NaHCO3量的培养
基,测定两者的TCID50。
将病毒液分成等量的11小瓶,其中4小瓶分别置50℃、60℃、70℃、80℃水溶中1h,另6瓶置50℃水浴中分别感作5、10、15、30、60和180min,随后测定每瓶V的传染X。
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电子显微镜直接察看(透射电镜、磷钨酸负染)
超速离心积淀
滤过试验
取澄清的病毒液20ml,留出1ml作为比较,将节余的19ml病毒液在正压下依次经过孔
经为450nm、225nm、100nm和50nm的各级微孔,每经过一种孔径的滤膜就吸取1ml滤液用
为样品,并将节余的滤液经过一次滤膜。最后测定原病毒液以及各级滤液的TCID50。
病毒液种类TCID50/
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滤前病毒液
10
450nm孔径液
10
225nm孔径液
10
100nm孔径液
10
50nm孔径液
10
-
-
-
-
-
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免疫——血清学检查
目的:①新分别毒株的种类及型其他判断。
②检测发病动物体液中的Ab,或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的Ab效
价,认识病毒性Ab可否有明显的增加,进而判断V传染的存在。
(一)中和试验
固定病毒——稀释血清法中和试验
固定血清——稀释病毒法中和试验
(痘斑)减数试验
1)蚀斑技术
病毒蚀斑,又称空斑,指病毒在已长成的单层细胞上形成的限制性病灶。
原理:将病毒悬液作连续的10倍稀释,随后各取定量,接种于已经长成单层的敏感细胞上,并覆盖中性红琼脂糖,待其出现蚀斑后计数,即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑
单位。
用途:①用于病毒纯化;②测定病毒悬液中传生病毒的含量。
2)蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混淆物以及病毒——待检血清混淆物分别接种到单层细胞上,随
后覆盖营养琼脂或***纤维素,进行蚀斑测定,比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数,两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比比较组减少50%作为判断依照,血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫,尔后以待检病毒进行攻击,依照实验动物被保护的情况,判断待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长,而且需要大量的实验动物。
用途:(1)应用已知V判断未知V;
2)应用已知免疫血清判断未知V;
3)应用已知V判断未知血清。
(五)凝聚试验
定义:
颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)或表面载有抗原的颗粒状的物质(如聚苯乙烯胶乳、
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红细胞、炭素颗粒等),与相应抗体在电解质存在下凝聚成团的试验。
分类
直接凝聚试验:颗粒状Ag与相应Ab所发生的凝聚反响。(布氏杆菌)
间接凝聚试验(被动凝聚试验):可溶性抗原吸附到载体颗粒表面,与相应抗体所发生
的凝聚反响,能够证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝聚试验(反向被动凝聚试验):
将抗体吸附到颗粒表面与相应抗原所发生的凝聚反响。
间接血凝试验
胶乳凝聚试验
炭凝聚试验间接凝聚试验
皂土凝聚试验
脂质体凝聚试验
间接凝聚控制试验:先将被检的抗体(或抗原)与已知的抗原(或抗体)作用后,再
与抗体(或抗原)致敏的颗粒时行反响。
反向凝聚控制试验
间接凝聚试验的优点:快速、简略、特异、敏感
间接血凝试验(IHA)(PHA)
口蹄疫、猪瘟、弓形体、胸膜肺炎、衣原体
反向IHA:FMDV、水疱病病毒Ag、猪传染笥胃肠炎病毒Ag、小鹅瘟病毒Ag等。
红细胞作为载体的优点:
,简单获取。
,如蛋白质、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。
,比其他好多载体都更简单标准化和规格化。
缺点:简单破裂、难于保存
IHA的优点:
①敏感性高、特异性强、重复性和牢固性好,操作简略、反响快速。
②既可定性又可半定量,而且试剂价格廉价,不需要特别、复杂的设施。
注意:影响红细胞凝聚的因素好多:红细胞的根源,致敏条件、操作技术、标本中的杂质、
细菌污染和类属Ag常引起非特异性凝聚反响。
选择:好多种类动物的红细胞,包括人的0型红细胞都可用,但用得最多的是绵羊红细胞。
保存:用玻璃珠脱纤法收集或用肝素抗凝。
②无菌的红细胞在4℃冰箱中可保存3-4天。
②采血时加等量氏液和合适抗生素,4℃保存2周,但这样红细胞致敏时容液自凝。
醛化剂:甲醛、戊二醛、***醛、***醛—甲醛双固定、戊二醛—***醛双固定。
1)无菌采用绵羊静脉血,加至红细胞保存液内,4℃保存备用。
2)取红细胞悬液1份,、(),洗5遍,
并以该液配成8%红细腻悬液。
3)红细胞悬液1份+3%***醛液等量,24左右的室温中用电磁搅拌器迟缓搅拌17h。
配成8%悬液,——***醛固定红细胞悬液。
4)***醛固定红细胞悬液1份+等量3%甲醛液,如上搅拌17hr。
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