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课题1果酒和果醋的制作
一、实验原理
酶
酶
酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖,表达式为:C6H12O6+O2→CO2+H2O+能量
酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳,表达式为:C6H12O6→C2H5OH+CO2+能量
酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活:在有氧时,酵母菌大量繁殖,但是不起到发酵效果;在无氧时,繁殖速度减慢,但是此时可以进行发酵。在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖,再隔绝氧气进行发酵。20℃左右最适合酵母菌繁殖,酒精发酵的最佳温度是在18℃~25℃,pH最好是弱酸性。
酶
,当缺少糖源时和有氧条件下,可将乙醇(酒精)氧化成醋酸。表达式为:C2H5OH→CH3COOH+H2O;当氧气、糖源都充足时,醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
醋酸菌生长的最佳温度是在30℃~35℃
二、实验步骤
、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒。先用温水反复冲洗几次,再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒,晾干待用。
,去除枝梗和腐烂的子粒。
~2遍除去污物,注意不要反复多次冲洗。
,将其装入发酵瓶中或将葡萄打成浆后,用洁净的纱布过滤至发酵瓶中,盖好瓶盖。如果没有合适的发酵装置,可以用500mL的塑料瓶替代,但注入的果汁量不要超过塑料瓶总体积的2/3。
。
,因此需要及时排气,防止发酵瓶爆裂。如果使用简易的发酵装置,如瓶子(最好选用塑料瓶),每天要拧松瓶盖2~4次,进行排气。
,可以开始进行取样检验工作。例如,可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。
,可以在发酵液中加入醋酸菌或醋曲,然后将装置转移至30~35℃的条件下发酵,适时向发酵液中充气。如果找不到醋酸菌菌种或醋曲,可尝试自然接种,但效果不是很好。如果没有充气装置,可以将瓶盖打开,在瓶口盖上纱布,以减少空气中尘土等的污染。
三、注意事项
请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接?结合果酒、果醋的制作原理,你认为应该如何使用这个发酵装置?
充气口排气口
出料口
答:充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的;排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的;出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接,其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时,应该关闭充气口;制醋时,应将充气口连接气泵,输入氧气。
课题2腐乳的制作
实验原理
、酵母、曲霉、毛霉等多种,其中起主要作用的是毛霉。
,常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上,具有发达的白色菌丝。
;脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
二、实验步骤
×3cm×1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70%左右,水分过多则腐乳不易成形。
,粽叶可以提供菌种,并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放,周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时,将平盘用保鲜膜包裹,但不要封严,以免湿度太高,不利于毛霉的生长。
~18 ℃的地方。毛霉逐渐生长,大约5 d后豆腐表面丛生着直立菌丝。
,并呈淡黄色时,去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶,使豆腐块的热量和水分能够迅速散失,同时散去霉味。这一过程一般持续36 h以上。
,将豆腐间连接在一起的菌丝拉断,并整齐排列在容器内,准备腌制。
(以下称毛坯)与盐的质量分数比为5∶1。将培养毛坯时靠***盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边,将毛坯分层盘立摆放在容器中。分层加盐,并随层加高而增加盐量,在瓶口表面铺盐厚些,以防止杂菌从瓶口进入。约腌制8 d。
〔注〕用盐腌制时,注意盐都用量。盐的浓度过低,不足以抑制微生物生长,可能导致豆腐***变质;盐的浓度过高,会影响腐乳的口味。
、米酒和糖,按口味不同而配以各种香辛料(如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等)混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12%左右为宜。
〔注〕酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高,对蛋白酶的抑制作用也越大,使腐乳成熟期延长;酒精含量过低,蛋白酶的活性高,加快蛋白质的水解,杂菌繁殖快,豆腐易***,难以成块。
,用高压锅在100 ℃蒸汽灭菌30 min。将腐乳咸坯摆入瓶中,加入卤汤和辅料后,将瓶口用酒精灯加热灭菌,用胶条密封。在常温情况下,一般六个月可以成熟。
三、注意事项
。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐(白坯)上的生长。发酵的温度为15~18 ℃,此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长,而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5 d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用,一是使豆腐表面有一层菌膜包住,形成腐乳的“体”;二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶,有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料(红曲、面曲、酒酿),使蛋白酶作用缓慢,促进其他生化反应,生成腐乳的香气。
,有多个细胞核,进行无性繁殖。毛霉是食品加工业中的重要微生物,它可以产生能够分解大豆蛋白的蛋白酶,常用于制作腐乳和豆豉。
课题3探讨加酶洗衣粉的洗剂效果
一、实验原理
,目前常用的酶制剂有四类:蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶,其中,应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽,使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质,使洗衣粉具有更好的去污能力。
,我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题:一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果有什么不同;二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好,三是添加不同种类的酶的的洗衣粉,其洗剂效果有哪些区别。
二、实验步骤
1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同
①在2个编号的烧杯里,分别注入500mL清水。
②取2块大小相等的白棉布,用滴管在每块白布上分别滴上等量的墨水,分别放入烧杯里,用玻璃棒搅拌。
③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中,保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份,分别放入2个烧杯中,用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。
⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果
2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件
①在3个编号的烧杯里,分别注入500mL清水。
②取3块大小相等的白棉布,用滴管在每块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶,分别放入烧杯里,用玻璃棒搅拌。
③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中,保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉3份,分别放入3个烧杯中,用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。
⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。
3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果
污染物
蛋白酶洗衣粉
脂肪酶洗衣粉
复合酶洗衣粉
普通洗衣粉
油渍
汗渍
血渍
观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。
三、注意事项
影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量,衣物的质料、大小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中,水温是我们要研究的对象,而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来确定水温,通常情况下,冬季、春季、秋季和夏季可分别选取5℃、15℃、25℃和35℃的水温,因为这4个水温是比较符合实际情况的,对现实也有指导意义。
。
在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式,应考虑其中哪一种比较科学?哪一种更有利于控制变量?再有,洗衣机又可以分为半自动和全自动两种,相比之下,采用全自动洗衣机比较好,并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机,其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想,这是因为作为实验材料的衣物,其大小、颜色、洁净程度等应该完全一致,而这并不容易做到;此外,人为地在衣物上增加污物,如血渍、油渍等,也令人难以接受。因此,选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时,可以控制布料的大小、颜色以及污物的量,使其相同;同时,也便于洗涤效果的比较。
、水质和洗衣粉用量的问题。
水的用量和布料的大小是成正比的。做实验用的布料不易过大,水量不易过多,但应该让布料充分浸泡在水中。水量和洗衣粉的用量可以参考下表。实验时可根据表中的数据换算出实际用量。如果在实验中使用手洗的方法,如课本中图4-4所示,使用1000mL的烧杯作为容器,可以用500mL的水,。
洗涤方式
机洗
手洗
水量
洗衣粉量
其他相关问题简述如下。实验中可以用滴管控制污物的量,待污物干燥后再进行实验;布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间;采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程;模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同。
课题4酵母细胞的固定化
一、实验原理
,将这种酶固定在一种颗粒状的载体上,再将这些酶颗粒装到一个反应柱内,柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔,而反应溶液却可以自由出入。生产过程中,将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入,使葡萄糖溶液流过反应柱,与固定化葡萄糖异构酶接触,转化成果糖,从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年,大大降低了生产成本,提高了果糖的产量和质量。
,包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说,酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定,而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大,而酶分子很小;个大的难以被吸附或结合,而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
固定化酶优点:使酶既能与反应物接触,又能与产物分离,还可以被反复利用。
固定化细胞优点:成本更低,操作更容易,可以催化一系列的化学反应。
二、实验步骤
1。细胞的活化
称取lg干酵母,放入50mL的小烧杯中,加人蒸馏水10mL,用玻璃棒搅拌,使酵母细胞混合均匀,成糊状,放置1h左右,使其活化。
【注】活化:让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态
2。
。放人200mL的烧杯中,加入150mL的蒸馏水,使其充分溶解,待用。
3。配制海藻酸钠溶液
,放入50mL小烧杯中。加人10mL水,用酒精灯加热,边加热边搅拌,将海藻酸钠调成糊状,直至完全溶化,用蒸馏水定容至10mL。注意,加热时要用小火,或者间断加热,反复几次,直到海藻酸钠溶化为止。
4。海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温,加人已活化的醉母细胞,进行充分搅拌,使其混合均匀,再转移至注射器中。
【注】冷却至室温的目的:防止杀死酵母菌
5。固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中,观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。
【注】CaCl2溶液的作用:使胶体聚沉
6使用固定化酵母细胞发酵
将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。
b)将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中,再加入固定好的
酵母细胞,置于25℃下发酵24h。
三、注意事项
:小火、间断加热、定容,如果加热太快,海藻酸钠会发生焦糊。
:冷却后再混合,注意混合均匀,不要进入气泡
:高度适宜,并匀速滴入
,以便Ca2+与Na+充分交换,形成的凝胶珠稳定。检验凝胶珠是否形成,可用下列方法:用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压,如果不容易破裂,没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠,还可以用手将凝胶珠在实验桌上用力摔打,如果凝胶珠很容易弹起,也表明制备的凝胶珠是成功的。
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色,说明海藻酸钠的浓度偏低,固定的酵母细胞数目较少;如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形,则说明海藻酸钠的浓度偏高,制作失败,需要再作尝试。
课题5DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言,就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点,选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解,而使杂质沉淀,或者相反,以达到分离目的。
此外,DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理,可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
、高温和洗涤剂的耐受性
蛋白酶能水解蛋白质,但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温,而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜,但对DNA没有影响。
在沸水浴条件下,DNA遇二苯***会被染成蓝色,因此二苯***可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验设计
实验材料的选取
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。
破碎细胞,获取含DNA的滤液
动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如,提取洋葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐,进行充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。
注意:
①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?
蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),从而释放出DNA。
②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?
洗涤剂是一些离子去污剂,能溶解细胞膜,有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。
③如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响?
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,影响实验结果,导致看不到丝状沉淀物、用二苯***鉴定不显示蓝色等。
④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?
可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
去除滤液中的杂质
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
注意:
①为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?
用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
②方案二与方案三的原理有什么不同?
方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋白质变性,与DNA分离。
DNA的析出与鉴定
将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液,静置2~3min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。
取两支20ml的试管,各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的二苯***试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
三、实验步骤—以洋葱为实验材料
,放入研钵中,加入少量石英砂助研,倒入10mL2mol/L的***化钠溶液,充分研磨。
洋葱含有挥发性刺激物,有效减少刺激,才能使实验顺利进行。上课前,教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿,使其凉透但又不能结冰;或将洋葱切成几大块,放入清水泡一会儿,让其挥发性刺激物溶于水,可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂,使DNA溶于2mol/L的***化钠溶液,没必要将洋葱研成粥糊状,后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时,切忌使用搅拌器(榨汁机)。使用搅拌器虽可以提高研磨效率,但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒,无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中,许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来,DNA藏在其中,无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。
,用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中,得到滤液。
%的酒精溶液20mL,沿烧杯壁缓缓倒入,不要震动或搅拌。
此时,烧杯中的液体分为上、下两层,下层较浑浊,上层澄清,很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出,用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中,切忌震动和搅拌(不震动易于分层,我们就能很容易观察到上清液中的丝状物;搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段,不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起,可改用表面打毛的牙签,DNA提取物就缠绕在牙签上了。
:取两支试管,编为1、2号,各加入2mol/L的***化钠溶液2mL,向1号试管中加入一些白色纤维状物,振荡使其溶解,然后向两支试管中各加入2mL二苯***试剂,沸水浴加热5分钟。
四、注意事项
,每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。
,动作要轻缓、柔和,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
***试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果。
:
,随浓度的升高,DNA的溶解度降低;,随浓度升高,DNA的溶解度升高。
,最好是塑料容器。
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程的DNA的损失。
微生物的实验室培养
一、基础知识
:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质,是进行微生物培养的物质基础。
(1)培养基的分类:
·培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。
在液体培养基中加入凝固剂琼脂(是从红藻中提取的一种多糖,在配制培养基中用作凝固剂)后,制成琼脂固体培养基。
微生物在固体培养基表面生长,可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。
液体培养基应用于工业或生活生产,固体培养基应用于微生物的分离和鉴定,半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。
·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。
合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成,其中成分的种类比例明确,常用于微生物的分离鉴定。
天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成,常用于实际工业生产。
·按照培养基的用途,可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。
选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物生长,促进所需要的微生物的生长。
鉴别培养基是根据微生物的特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的,用以鉴别不同类别的微生物。
(2)培养基的成分:培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
·碳源:能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源;糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
·氮源:能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+(无机氮源)蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有机氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。
·培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。
例如,培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素,培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性,培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性,培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件
,要注意以下几个方面:
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
,还有什么目的?
答:无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
①消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法,巴氏消毒法(对于一些不耐高温的液体)还有化学药剂(如酒精、***气、石炭酸等)消毒、紫外线消毒。
②灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
:
①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法;
②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法,所用器械是干热灭菌箱;
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法,所用器械是高压蒸汽灭菌锅。
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法,所用器械是紫外灯。
比较项
理化因素的作用强度
消灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被消灭
消毒
较为温和
部分生活状态的微生物
不能
灭菌
强烈
全部微生物
能
(1)制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
①方法步骤:计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
②倒平板操作:
,右手拿装有培养基的锥形瓶,左手拔出棉塞。
,将瓶口迅速通过火焰。
,右手将锥形瓶中的培养基(约10~20mL)倒入培养皿,左手立即盖上培养皿的皿盖。
,大约需5~10min。然后,将平板倒过来放置,使培养皿盖在下、皿底在上。
·倒平板操作的讨论
①培养基灭菌后,需要冷却到50℃左右时,才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度?
提示:可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时,就可以进行倒平板了。
②为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?
答:通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
③平板冷凝后,为什么要将平板倒置?
答:平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
④在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板还能用来培养微生物吗?为什么?
答:空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板培养微生物。
(2)纯化大肠杆菌
①微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
②平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。
③稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
④用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是:使聚集在一起的微生物分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落,以便于纯化菌种。
(3)平板划线法操作步骤:
①将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环烧红。
②在火焰旁冷却接种环,并打开棉塞。
③将试管口通过火焰。
④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。
⑤将试管通过火焰,并塞上棉塞。
⑥左手将皿盖打开一条缝隙,右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内,划三至五条平行线,盖上皿盖。注意不要划破培养皿。
⑦灼烧接种环,待其冷却后,从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作,在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
⑧将平板倒置放入培养箱中培养。
·平板划线操作的讨论
?在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗?为什么?
答:操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。
,为什么要等其冷却后再进行划线?
答:以免接种环温度太高,杀死菌种。
,为什么总是从上一次划线的末端开始划线?
答:划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(4)涂布平板操作的步骤:
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
②取少量菌液,滴加到培养基表面。
③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃尽后,冷却8~10s。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
·涂布平板操作的讨论
。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求,想一想,第二步应如何进行无菌操作?
提示:应从操作的各个细节保证“无菌”。例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围;等等。
(4)菌种的保存
(1)对于频繁使用的菌种,可以采用临时保藏的方法。
①临时保藏方法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上,在合适的温度下培养。当菌落长成后,将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3~6个月,都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
②缺点:这种方法保存的时间不长,菌种容易被污染或产生变异。
(2)对于需要长期保存的菌种,可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中,装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中,与甘油充分混匀后,放在-20℃的冷冻箱中保存。
(5)疑难解答
①生物的营养
营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动,保证发育、生殖所需的外源物质。
人及动物的营养物质:水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
植物的营养物质:矿质元素、水、二氧化碳等三类。
微生物的营养物质:水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。
②确定培养基制作是否合格的方法
将未接种的培养基在恒温箱中保温1~2天,无菌落生长,说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制备。