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专题1基因工程
概念:又叫DNA重组技术,是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
基因工程工具
来源:主要从原核生物分离纯化
(“分子手术刀”)
限制性核酸内切酶(限制酶)作用:识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列,并使特定部位的磷酸二酯键断开
结果:产生黏性末端或平末端
E·coliDNA连接酶
DNA连接酶
“分子缝合针”
基来源:大肠杆菌
本作用:连接黏性末端
T4DNA连接酶
工来源:T4噬菌体
具作用:可连接两种末端
常用载体:质粒
能在受体细胞中复制并稳定保存
基因进入受体细胞的载体必备条件具有一至多个限制酶切点
(“分子运输车”)具有标记基因
其他载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒
目的基因:主要指编码蛋白质的结构基因
从基文库中获取目的基因
方法利用PCR技术扩增目的基因
用化学方法直接人工合成
基因组文库
部分基因文库(cDNA文库)
目的基因的获取
目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,
使目的基因能够表达和发挥作用
组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因
基因表达载体
基因工程的操作程序
的构建
将目的基因导入植物细胞:农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
将目的基因导入动物细胞:显微注射法
Ca2+含重组DNA分
将目的基因导入微生物细胞:受体细胞↓感受态子的缓冲液感受态细胞吸
细胞收DNA分子
将目
的基
因导
入受
体细
胞
检测转基因生物的染色体DNA是否插入了目的基因(DNA分子杂交法)
↓
检测目的基因是否转录出了mRNA(分子杂交法)
↓
检测目的基因是否翻译成蛋白质(抗原—抗体杂交法)
目的基因的
检测与鉴定
抗虫转基因植物—减轻农药对环境的污染
植物基因工程抗病转基因植物
抗逆转基因植物
利用转基因改良植物的品质
提高动物生长速度
改善畜产品的品质
动物基因工程用转基因动物生产药物
用转基因动物作器官移植的供体
基因工程药品的生产
基因工程
应用
把正常基因导入体内,使该基因表达产物发挥作用
基因治疗体外基因治疗
方法
体内基因治疗
⑴来源:多数来自原核生物。
⑵作用特点:
①将外来的DNA切断,它们能即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,达到保护自身的目的。
②专一性:只能识别DNA分子中特定的核苷酸序列,且只能在每一条链中特定的部位进行切割,这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列。
(3)作用结果:形成黏性末端或平末端
(4)作用实质:使特定部位的两核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(1)作用实质:使两DNA的双链片段末端缺口之间形成磷酸二酯键而连接成一个DNA。
E·coliDNA连接酶来源:大肠杆菌
(2)常用种类及作用作用:使黏性末端之间连接
T4DNA连接酶来源:T4噬菌体
作用:几能连接黏性末端,也能连接
平末端,但后者效率低
作用:将单个核苷酸加到已有的核苷酸链末端上,形成磷酸二酯键。
运载体是基因进入受体细胞的载体。在基因操作过程中使用载体有两个目的:一是将它作为运载工具,将目的基因转移到受体细胞中去;二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。
作为运载体必须具备以下条件:①能够在宿主细胞内复制并稳定地保存;②具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接;③具有某些标记基因,便于进行筛选。
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需蛋白质
定向地改造生物的遗传性状,以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果
生产自然界没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上,延伸出来的第二代基因工程。因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质,必须通过基因修饰或基因合成实现
专题2细胞工程
基理论基础:细胞的全能性
本脱分化再分化
技植物组织培养:离体的高度愈伤组织试管苗植物体
术常用分化的组织
技术过程:植物细胞A原生质体A
植物细胞工程
植物体细↑
胞杂交酶杂种杂种
↓细胞植物体
植物细胞B原生质体B
意义:克服远缘杂交不亲和的障碍
植物繁殖
新途径
微型繁殖
作物脱毒
制造人工种子
单倍体育种
突变体的利用
应用
作物新品种的培育
细胞产物的工厂化生产
概念:从动物机体中取出相关的组织,将他分散成单个细胞,
然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。
细胞细胞贴壁,遗传物
过程:取材悬浮液出现接触抑制质未变(10代—50代)
无菌、无毒的环境
条件营养──合成培养基
温度和pH(±℃,~)
气体环境
生物制品的生产
应用转基因动物的培养
检测有毒物质
医学研究
概念:体细胞核核移植发育
去核卵细胞重组细胞胚胎动物体
过程:去核卵母细胞电刺激胚胎移植生出
供体细胞重组细胞代孕母体子宫幼体
畜牧业:加速家畜遗传改良进程,促进优良畜群繁育
保护濒危物种,增大存活量
应用前景医药:生物反应器、移植性克隆
科研:胚胎发育及衰老的研究、用作疾病模型
存在问题:成功率低、克隆动物的健康问题、克隆动物食品的安全性问题
概念:两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程
原理:生物膜的流动性
方法:聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等
突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能
意义细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的研究
单克隆抗体的制造
制备:
B淋巴细胞
杂交瘤细胞产生特定抗单克隆抗体
骨髓瘤细胞融合筛选体的细胞群培养、提取
特点:化学性质专一、特异性强灵敏度高,并可以大量制备
应用:作为诊断手段、用于治疗疾病和运载药物
动物细
胞培养
体细胞核移植
动物细胞工程
动物细
融合胞
单克隆
抗体
植物组织培养
动物细胞培养
原理
细胞的全能性
细胞的增殖
培养基的物理性质
固体
液体(合成培养基)
培养基的成分
水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂、激素等
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
结果
培育成新的植株或组织
培育成细胞系或细胞株
培养目的
①植株快速繁殖
②脱毒植株的培育
③人工种子
④生产药物、杀虫剂等
⑤转基因植物的培育
①蛋白质生物制品的生产②皮肤移植材料的培育
③检测有毒物质
④生理、病理、药理学研究
取材
植物幼嫩的部位或或花药等
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
其他条件
均为无菌操作,需要适宜的温度、pH、O2等条件
(1)植物组织培养
(2)动物细胞培养①概念:取动物体的相关组织分散成单个细胞后,在适宜培养基中使细胞生长和增殖的过程。
②基本过程:培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官组织,将组织取出来以后,先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶进行处理,使细胞分散成单个细胞,然后配制一定浓度的悬浮液,在培养瓶中进行原代培养。随着细胞的生长和增殖,大多数细胞不适应悬浮生长,它们必须在固定的表面上生长和分裂,细胞在培养瓶中贴壁生长,随着细胞越来越多,贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时就停止分裂增殖,这种现象叫接触抑制。这样就需定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来,配成细胞悬浮液,分装到两个或两上以上的培养瓶中进行传代培养。在传代培养中出现细胞株和细胞系两种类型。(如图所示)
植物体细胞杂交
动物细胞融合
细胞融合原理
细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞的全能性
细胞融合方法
用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散后,诱导细胞融合
诱导
手段
离心、电刺激、振动、显微操作、
聚乙二醇等诱导
与植物体细胞杂交相比,还可用灭活的病毒诱导
结果
获取杂种植株
获得杂种细胞,以生产细胞产品
用途
克服远缘杂交不亲和的障碍,扩展杂交亲本范围,培育新品种
制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等
(1)植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交就是将不同种植物的体细胞,在一定条件下融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。植物体细胞杂交的障碍,一是植物细胞有细胞壁,二是如何诱导植物细胞融合。利用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁,这样可保持原生质体的活性。去除细胞壁的原生质体再利用人工诱导的方法融合,人工诱导的方法包括物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等,化学法一般是用聚乙二醇(PEG)诱导原生质体融合。原生质体融合后的细胞是杂种细胞,利用植物组织培养技术把杂种细胞培养成杂种植株。
(2)动物体细胞核移植
动物体细胞核移植依据的原理还是细胞的全能性。动物细胞的全能性随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到抑制,全能性表达很难,但是动物的细胞核内仍含有该种动物的全部遗传基因,具有发育成完整个体的潜能,即动物的细胞核仍具有全能性。但只靠动物的细胞核是不行的,必需提供促进细胞核表达全能性的物质和营养条件,还要保证细胞的完整性,这样去核的卵母细胞是最合适的细胞。因为卵母细胞体积大、易操作,含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。通过核移植形成重组细胞,重组细胞必须通过细胞培养形成重组胚胎,然后才能进行胚胎移植,进入代孕母体,发育成成熟胚胎,产出即是克隆动物,该动物的核基因型与供体体细胞完全相同,该技术是一种无性繁殖技术。
(3)动物细胞融合、单克隆抗体制备
细胞融合是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程,也叫细胞杂交。杂交细胞是具有两个或多个细胞的遗传信息的单核细胞。杂交细胞的形成需要人工诱导,如聚乙二醇(PEG)、灭活的仙台病毒、电激等。融合的细胞要繁殖就要进行动物细胞的培养,通过动物细胞的培养,杂交细胞表现出两个亲本各自的优良特点。
单克隆抗体的制备,首先应获得杂交瘤细胞,其过程是用已免疫的效应B细胞和骨髓瘤细胞杂交获得三种细胞:BB细胞、B瘤细胞、瘤瘤细胞,然后用选择培养基筛选获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞要发挥其繁殖快、产生特异性抗体的优点,应通过动物细胞培养才能实现。所以无论是动物细胞融合还是单克隆抗体的制备,都是以动物细胞培养为基础的。
技术
原理
优点
缺点
诱变育种
基因突变
提高生物便宜的频率,使后代变异性状较快稳定;可大幅度改良某些性状,缩短育种进程
盲目性大,需大量处理供试材料
杂交育种
基因重组
使位于不同个体的优良性状集中于一个个体
周期长,难以克服远缘杂交不亲和的障碍
单倍体
育种
染色体变异
获得个体均为纯种,明显缩短育种年限
技术复杂,须与杂交育种配合、且需细胞工程参与
多倍体
育种
染色体变异
器官大,提高产量和营养成分
适用于植物,动物方面难以展开
基因工程育种
分子遗传学原理
打破物种界限,定向地改造生物遗传性状
技术要求高
细胞工程育种
细胞生物学和分子生物学原理、基因突变
植物体细胞杂交可以克服远缘杂交不亲和的障碍,扩大了用于杂交的亲本范围;定向改造生物遗传性状
远缘杂种不能按人们的需要表现出亲代的优良性状
专题3胚胎工程
一、知识网络
时间:初情期以后
场所:睾丸曲细精管二者重要区别:
体精子的发生哺乳动物卵泡
内过程:三个阶段的形成和在卵
受巢内的储备是
精在出生前完成
和时间:性别分化以后的,而精子是从
早卵子的发生场所:卵巢输卵管初情期开始的
期过程
胚受精前的准备阶段准备阶段1:精子获能
胎受精准备阶段2:卵子的准备
发受精阶段:顶体反应、透明带反应、卵黄膜封闭作用
育胚胎发育:受精卵→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚
试管动物技术:是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件
下成熟和受精,并通过培养发育为早期胚胎
后,再经移植产生后代的技术
胚
胎
工程
①促性腺激素处理
卵母细胞的采集和培养
②超声波探测仪、内窥镜等
①假***法
体外采集②手握法
体受精精子的采集和获能③电刺激法
外
受获能①培养法
精②化学法
和受精:获能的精子和培养成熟的卵子发生作用
早
期培养液成分:无机盐、有机盐、维生素、激素、
胚早期胚氨基酸、核苷酸、血清等
胎胎培养不同动物胚胎移植时间不同
培定义
养现状和意义
胚胎移植生理学基础:与供体、受体的生理状况有关
胚胎工程的基本程序
应用及前景定义
胚胎分割
设备:实体显微镜和显微操作仪
定义:由早期胚胎或原始性腺分离出来的一类细胞。
胚胎干细胞应用
、卵子的发生
两者都是在***官内,经过减数分裂而形成的。关于两者的区别应注意以下几点:
(1)卵泡的形成和卵巢内的储备,是在出生前完成的,这是两者在发生上的重要区别,但不是唯一区别。
(2)精子的发生中减数分裂的两次分裂是连续的,在曲细精管内进行的,场所是唯一的。卵子发生减数分裂的两次分裂是不连续的,第一次是在卵巢内完成,形成的次级精母细胞和第一极体进入输卵管,与精子的结合过程中完成第二次减数分裂。因此,场所在卵巢和输卵管两处,也不是唯一的。
(3)减数分裂中细胞质的分配、形成成熟性生殖细胞的数目、是否需要变形,都是两者在发生上的区别。
现将二者的发生比较如下:
项目
精子发生
卵子发生
区别
场所
睾丸的曲细精管(场所惟一)
卵巢(MI)、输卵管(MII)
(场所不惟一)
时间
初情期后
性别分化后开始,卵泡(含次级卵母细胞和第一极体的形成)的形成和在卵巢内的储备,是在出生前(胎儿时期)完成的,减II是在精子和卵子的结合过程中(即受精过程中)完成的
过程特点
①MI和MII是连续的,需要变形
②细胞质均等分配
①MI和MII是不连续的,不需要变形
②细胞质不均等分配
结果
形成4个精子
形成一个卵细胞和3个极体
相同点
原始生殖细胞的增殖为有丝分裂
生殖细胞的成熟为减数分裂
成熟过程均经一次复制和两次分裂,子细胞中染色体数目减半
①成熟的精子并不代表具有受精的能力,必须获能后才具备受精能力,刚刚排出的精子,不能立即与卵子受精,必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后,才能获得受精能力,这一现象称为精子获能。
②排出的卵子并未成熟且成熟程度因动物种类不同而异,但只有达到减II中期时,才具备与精子受精的能力。
③对于受精阶段的理解,要先弄清卵母细胞的层层基本结构,才能掌握精子穿行的路线和发生的反应。
④对于受精的标志和受精完成的标志应该区分开,受精的标志是第二极体的形成,受精完成的标志是雌雄原核融合成合子。雌雄原核不能理解成卵子、精子原来的细胞核,而是在原来细胞核的基础上形成的新核,原核膜已破裂。
⑤受精卵中的遗传物质中,核遗传物质一半来自精子(父方),一半来自卵子(母方),
质遗传物质几乎全来自卵子。
精子和卵子受精后,应将受精卵放入发育培养液中继续培养。
(1)发育培养液
①用途:精子和卵子在体外受精后,用于受精卵的继续培养。
②成分:水、无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、动物血清等。
(2)过程(以牛为例)
大致为:体外受精→良种牛早期胚胎→胚胎移植→健康受体牛→良种犊牛→成熟期牛
(1)实质:是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换,而胚胎本身的遗传物质并不发生改变,因此各种性状能保持其原来的优良特性。这是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2)基本程序
下面以牛胚胎移植为例,移植的基本程序如下:
(3)胚胎移植成功与否的两个条件
一是胚胎移植一般应在同种的雌性供体和受体之间进行。这是因为,同种动物之间的生理特征相近,进行胚胎移植易于成功。在这里同“种”是指同“物种”。例如:加拿大荷斯坦奶牛胚胎移植给我国黄牛,生出了荷斯坦奶牛。
二是进行胚胎移植的供体和受体的生理状态要相同。
(1)胚胎干细胞,简称ES细胞或EK细胞,是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞,具有胚胎细胞的特性。
它能长期维持未分化状态,又有全能分化的潜能和无限增殖的能力,在体外培养时仍能维持正常和稳定的染色体组型,在特定的环境诱导下,能分化成各类细胞系。因此,它是唯一不死的全能或多能细胞,并能够无限分化,它能制造机体需要的全部细胞。
(2)应用前景
ES细胞的分离和培养成功是胚胎工程中的重大成就之一,在基础生物学、畜牧学和医学上都具有十分重要的应用价值。
①ES细胞可用于治疗人类的某些顽症
利用ES细胞可以被诱导分化成新的组织细胞的特性,移植ES细胞可以使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。
②培育成组织器官,用于器官移植。
③对ES细胞的培养和诱导,为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效手段。
④ES细胞可用于对哺乳动物个体发生和发育规律的研究。
专题4生物技术的安全性和伦理问题