文档介绍：实时荧光定量PCR
卢瑶瑶、黄志聪佘碧芳、李家威
实时荧光定量PCR技术研究概述
问题
诞生
方法
应用
原理
诞生
实时荧光定量PCR( real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction, RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,即通常所说RT-PCR技术。
原理
1、非探针类(SYBR Green I 法)
SYBR Green I 是一种结合于双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ,发射波长最大约为 520nm 。在 PCR 反应体系中,加入过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
2、探针类(TaqMan探针法)
方法
荧光定量PCR
方法的确定
目的基因的
查找和比对
引物、
探针的
合成
优化
待测品的制备
荧光曲线与
标准曲线的
制作
通过标准曲线对
数据进行分析
标准品的制备
引物、探针
的设计
按荧光产生的原理有两种方法:荧光探针法和荧光染料法。
染料法利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。与常规PCR类似,唯一区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。
探针法:与常规PCR的不同之处在于:在上下游引物外还加入了让具有序列特异性的探针(探针本身具有荧光标记),该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合,与染料法相比,提高了实验的特异性。目前市场上探针多样,其中以TaqMan探针应用最为广泛。
荧光素:FAM、Texas red、LC-Red640,LC-Red705 等
1、荧光定量PCR方法和荧光标记素的选择与确定
2、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比对
●。
●通过BLAST对该目的基因进行对比,找出保守序列。
3、引物的设计与合成:Primer Premier
成
功
4、探针的设计与合成:DNAstar软件中的Seqman软件
选择高品质的引物探针合成商。
5、标准品的制备
(1)选择一个已知起始拷贝数(起始模板数)的样品
(2)反应体系的配置
(3)反应条件的设置
(4)反应体系与条件的优化
2017/8/23
(1)、反应体系的配置