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免疫学检测与免疫学技术12学时免疫学实验第一次
医学免疫学免疫学检测与免疫学技术免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子等的实验手段,以及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。
免疫学技术的应用极为广泛,在疾病的诊断、疗效评价及理论研究等方面发挥重要作用。
免疫检测技术细胞免疫技术免疫制备技术应用1、利用已知抗原检测未知抗体
(1)检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病:伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。
(2)检测自身抗体,诊断自身免疫病:SLE、类风湿性关节炎等2、利用已知抗体检测未知抗原
(1)鉴定病原菌:诊断疾病(2)检测肿瘤相关抗原:检测甲胎蛋白以诊断肝癌(3)检测血型抗原、HLA抗原:鉴定血型,亲子鉴定(4)检测药物半抗原:确认运动员是否服用兴奋剂抗原抗体结合反应的原理及特点杀菌、溶菌、调理、中和***体内免疫病理损伤—超敏反应、免疫性疾病等体外:凝集、沉淀、溶细胞、中和***、补体结合等抗原抗体结合反应的原理及特点抗原抗体高度互补结合力紧密接触带电离子异性相吸静电引力抗分子极化作用最小范德华引力原抗形成氢键最具特异性氢键引力体结形成疏水基团作用最大疏水作用力合比例合适可见反应抗原抗体结合反应的特点(一)特异性(specificity)
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概念:一种抗原只能与其相应的抗体结合起反应分子基础:Ag-ADHVR-Ab空间结构高度互补VH和VL各具三个HVR与AD互补免疫学检测中常用已知Ag检测未知Ab,反之亦然。
意义相对性:当抗原之间有相同或相似结构的AD时(共同抗原)
交叉反应(crossreaction)
抗原抗体结合反应的特点特异性反应无反应抗原抗体结合反应的特点(二)比例性(proportionality)
指抗原抗体的量比关系,即只有当抗原抗体的浓度比例适当时,才出现可见反应。
1929年Heidelberger以固定Ab量逐渐增加Ag量的试验发现带现象。
1977年Green把此现象称为钩状效应(hookeffect),包括前后带现象。指免疫检测中由于抗原、抗体浓度比例不合适而致检测结果呈假阴性的现象。
抗原抗体结合反应的特点抗原抗体结合反应的特点抗原抗体结合反应的特点(三)可逆性(reversibility)
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Ag+Ab一定条件Ag—Ab(动态平衡)
解离抗原抗体结合反应的特点(四)阶段性两个阶段特异性结合可见反应阶段数秒~数分钟肉眼不可见数分~数小时肉眼可见抗原抗体结合反应的特点(五)敏感性抗原抗体反应具有较高的敏感性,不仅可以较为精确地定性,还可用于检测极微量的抗原或抗体。
灵敏度>化学方法影响抗原抗体反应的因素(一)电解质作用:中和胶体表面电荷,破坏水化层,使Ag-Ab聚集。
常用:%NS,PBS、Ca2+、Mg2+等。
转化NaCl亲水胶体疏水胶体可见反应影响抗原抗体反应的因素(二)酸碱度Ag、Ab多为蛋白质,具***电离特性,有其故有的pI,pH过高或过低均可影响Ag、Ab反应。一般:pH6~8为宜。注意:自凝现象——即pH达到或接近颗粒性抗原的pI时,引起的抗原非特异性自身凝集现象。
酸凝——pH过低时造成的蛋白质自凝现象。
酸性增强中性碱性增强影响抗原抗体反应的因素(三)温度影响反应速度一般:15~40℃为宜最适温度:37℃过高(>56℃):Ag-Ab解离,Ag、Ab变性,(四)震荡补体失活促进反应速度免疫学检测技术的评价标准(5S)
Specificity(特异):检测信号针对性和排他性Sensitivity(灵敏):可测出的最低含量Simplicity(简便):操作是否方便Safety(安全):是否有污染,对操作者的伤害Saving(节约):性能/价格比免疫检验技术发展进程的主要阶段自然的肉眼观察的抗原抗体反应(沉淀反应、凝集反应)加速的肉眼观察的抗原抗体反应(电泳技术、分离技术)标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性自动化检验仪器与免疫反应原理结合,加快反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合抗原抗体反应的基本类型反应类型实验技术直接凝集试验凝集反应间接凝集试验抗球蛋白试验沉淀反应液相沉淀试验免疫电泳技术补体溶血试验补体参与的反应补体结合试验结果判断观察凝集现象同上同上观察沉淀,检测浊度观察扫描沉淀峰、沉淀弧观察测定溶血现象同上抗原抗体反应的基本类型反应类型中和反应标记免疫反应实验技术病毒中和试验***中和试验荧光免疫技术放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术金免疫技术结果判断检测病毒感染性检测外***毒性检测荧光现象检测放射性强度检测酶底物显色检测发光强度检测金颗粒沉淀凝集反应凝集反应(Agglutination)
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颗粒性抗原(如细菌、细胞)与相应抗体,在适当电解质存在的条件下,经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。
凝集反应(Agglutination)
一、凝集反应的一般原理通常,细菌和红细胞等颗粒性抗原在悬液中带弱负电荷,周围吸引一层与之牢固结合的正离子,外面又排列一层松散的负离子层,构成一个双离子层,使相互排斥。
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当特异性抗体与相应抗原颗粒互补结合时,抗体的交联作用克服了抗原颗粒表面的电位,而使颗粒聚集在一起。
凝集反应(Agglutination)
二、凝集反应的用途
(1)定性检测即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性。
(2)定量检测即将标本作一系列倍比稀释后进行反应,以出现50%凝集的最高稀释度作为滴度。
凝集反应方法简便,敏感性高,临床应用广泛。
凝集反应(Agglutination)
三、凝集反应的分类两大类直接凝集反应玻片凝集反应试管凝集反应间接凝集反应乳胶凝集反应碳素凝集反应间接血凝反应凝集反应(Agglutination)
(一)直接凝集试验抗原(颗粒性)+相应抗体—电解—质肉眼可见凝集物+
颗粒性抗原相应抗体凝集凝集反应(Agglutination)
实验报告玻片凝集试验实验目的:了解玻片凝集实验的原理、操作及意义实验原理:
实验器材及试剂:玻片、滴管、记号笔、无菌布、诊断血清、
NS、接种环,甲乙两菌培养皿、酒精灯凝集反应(Agglutination)
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实验报告玻片凝集步骤示意图甲菌12乙菌34第一步:2、4孔:加生理盐水你交到地第二步:1、3孔:加痢疾杆菌诊断血清第三步:无菌取需鉴定的甲菌,先放2号孔混匀,再取一环放1号孔第四步:无菌取需鉴定的乙菌,先放4号孔混匀,再取一环放3号孔凝集反应(Agglutination)
实验报告注意事项:
,在实验中应严格无菌操作,遵守实验规则,用后的载玻片应立即放入盛有消毒液的容器中,接种环必须作烧灼处理。
,不宜过多,与诊断血清混合涂抹时,必须将细菌打匀,混合均匀,但不宜涂的太宽,以免干涸而影响结果观察。
凝集反应(Agglutination)
玻片凝集试验结果观察:
此法简便、快捷,适用于:(Agglutination)
实验报告试管凝集试验实验目的:了解试管凝集实验的原理、操作及意义,掌握连续倍比稀释法及效价的概念。
实验原理:试管凝集试验为半定量试验方法,常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的待检血清混合,经过一段时间反应后,观察每管内抗原凝集程度,通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价,亦称为滴度。
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实验器材及试剂:试管、滴管、记号笔、NS、伤寒杆菌H、
O抗原、待检血清凝集反应(Agglutination)
试管凝集试验步骤示意图实验报告凝集反应(Agglutination)
实验报告注意事项:
,取样和加样应精确,稀释血清时应仔细且逐管进行,防止跳管,严格按照实验步骤进行。
,最好不要震摇试管,以免将凝集物摇散而影响他人观察。
凝集反应(Agglutination)
试管凝集试验结果分析++++++++++--
稀释度:1:401:801:1601:3201:640control凝集反应(Agglutination)
试管凝集试验结果分析凝集反应(Agglutination)
试管凝集试验结果分析肥达反应是诊断伤寒副伤寒的辅助诊断。其结果的解释必须结合临床变现和病程,病史,以及地区流行病学情况。机体患伤寒、副伤寒,一般于发病后1—2周内血液中出现特异性抗体并且随着病程延长而效价渐升,此时即可为阳性,第4周可达峰值,以后又逐渐降低。一般以“O”凝集效价在1/80或以上和“H”在1/160或以上为阳性。
凝集反应(Agglutination)
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试管凝集试验结果分析O抗体主要是IgM,出现较早;H抗体主要是IgG,出现较晚。根据此特点,肥达试验结果有如下诊断价值:
二者均超过正常值,患伤寒的可能性大。二者均在正常值内,患伤寒的可能性小。H抗体效价超过正常值,O抗体效价正常,可能是接种了伤寒菌苗或者是接种的回忆反应。O抗体效价超过正常值,H抗体效价正常,可能是伤寒早期或者其他沙门氏菌感染。