文档介绍：生物化学实验讲义
实验一蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应
实验目的
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,了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。,
一、茚三***反应
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三***反应产生黄色物质外,所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三***反应生成蓝紫色物质。
β-丙氨酸、氨和许多一级***都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二***吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此,虽然蛋白质和氨基酸均有茚三***反应,但能与茚三***呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏,1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三***反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三***被还原成还原型茚三***;第二步是所形成的还原型茚三***同另一个水合茚三***分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。
、仪器与试剂
蛋白质溶液;新鲜鸡蛋清溶液(蛋清∶水=1∶9);%甘氨酸溶液;%茚三***水溶液;%茚三***-乙醇溶液
①%甘氨酸溶液1ml,%茚三***水溶液,混匀,在沸水浴中加热1~2分钟,观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
②%甘氨酸溶液,风干后,%茚三***乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。
二、黄色反应
含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸,遇***后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应,苯丙氨酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
、仪器与试剂
鸡蛋清溶液;大豆提取液(将大豆浸泡充分吸胀后,研磨成浆状用纱布过滤);头发;指甲;%苯酚溶液;浓***;%色氨酸溶液;%酪氨酸溶液;10%氢氧化钠溶液
向7个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象,有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入
10%氢氧化钠溶液至碱性,观察颜色变化。
管号
1
2
3
4
5
6
7
材料
(滴)
鸡蛋清
溶液
4
指甲
少许
头发
少许
%
色氨酸
4
%
酪氨酸
4
浓***/(滴)
2
4
40
40
4
4
4
现象
三、蛋白质沉淀反应
蛋白质是亲水胶体,当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后,即自溶液中沉淀析出,此现象叫蛋白质的沉淀反应。
(一)蛋白质的盐析作用
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降,故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时,蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关:①蛋白质分子被浓盐脱水;②分子所带电荷被中和。
蛋白质的盐析作用是可逆过程,用盐析方法沉淀蛋白质时,较少引起蛋白质变性,经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出,而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
、仪器与试剂
鸡蛋清溶液(蛋清∶水=1∶9);固体硫酸铵;饱和硫酸铵溶( 称取377 g硫酸铵溶于20℃500ml 的蒸馏水中。硫酸铵在20℃水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在,同时可加热助溶)。
取鸡蛋清溶液约 5ml 于试管中,再加入等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。将管内混合液过滤,向滤液中加入硫酸铵粉末,至硫酸铵饱和不再溶解为止,此时析出的沉淀为清蛋白。
(二)重金属盐类沉淀蛋白质
溶液 pH 在蛋白质等电点以上时,重金属盐类(如 Pb 2+ 、Cu 2+ 、Hg 2+ 及 Ag + 等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全,故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意,在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时,不可过量,否则将引起沉淀再溶解。
、仪器与试剂
鸡蛋清溶液(蛋清∶水=1∶9);5%CuS04 溶液;3%AgNO3 溶