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蛋白质工程第四讲分离纯化与分析(与“分离”有关的文档共27张).pptx

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蛋白质工程第四讲分离纯化与分析(与“分离”有关的文档共27张).pptx

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第一页,共27页。
一、分离纯化是分析的重要过程:
针对分析目的不同,对分析对象的要求和采取的措施不同。
若分析过程干扰很小,特异性很高,不需要对样品处理可直接测定。如:抗原及其抗体检测,配体及其配基等。
多数样品常常需要处理,才能满足检测的要求。如:蛋白质结构分析、动力学(变复性)分析、酶学性质研究等,纯度要求很高、避免干扰分析。
为了保证分析的准确度,避免检测体系中某些物质的干扰,往往对样品进行处理。
第二页,共27页。
二、分离分析的含义:
1、分离过程本身可以是分析过程
样品干扰严重,需通过分离再检查,
分离过程和分析过程耦合,分析性色谱技术(HPLC、TLC)
2、分离过程的分析——优化纯化工艺
分离过程管理:定性分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等
3、基本要求:
客观、准确性,反映分析对象(目的物质)的真实性。
4、分析方法要求:
选择性(特异性)、精确度、灵敏度、重复性等
第一节概述
第三页,共27页。
三、如何理解分离纯化与分析(三个层次)
物质的分析离不开分离:
分析要求样品的纯度:对样品进行分离纯化:如蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析;
物质分离纯化过程离不开分析检测:
分离组分的收集、纯度、含量和组分分析;即分离过程管理。
分离纯化过程即是分析检测过程:
电泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄层层析(TLC)等;
分析是对事物的感知,是眼睛、是手段
第四页,共27页。
一、概述
1、一般原理:
依据分离对象(物质)的溶解度、大小在相态中的分配等特性对物质进行分离纯化。
2、基本程序:样品处理、粗分和精分(例如:蛋白质的分离纯化)
3、分类:
初级分离:沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等
精制纯化:
吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析
第二节分离与纯化
第五页,共27页。
二、初级分离(要求:灵活运用)
目的——分离对象(物质)初步分离、浓缩、富集的过程。
方法及原理:
1、沉淀分级分离:
盐析分级:中性盐(NH4SO4、Na2SO4等等),例如蛋白酶等蛋白质类
等电点分级:
有机溶剂:
热沉淀:
其它:
盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、
三***乙酸、PEG、重金属等
联合使用:盐析—等电点
盐析原理示意图
第六页,共27页。
2、膜分离:
膜分离方法及原理:透析,微滤,纳滤,超滤,反渗透,电渗析
膜材料和特性:
有机膜:(醋酸纤维素、硝基纤维素、聚砜膜、聚砜酰***膜、聚丙烯***膜等)
陶瓷膜:陶瓷材料
膜组件:管式膜组件,平板式膜组件,螺旋卷式膜组件,中空纤维(毛细管)等
应用:菌体分离,小分子产物分离和回收,蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等,膜生物反应器。
3、萃取:
4、离心:
分类:低速离心、高速离心、超速离心
分离方式:差速离心、浮力密度离心(连续梯度、非连续梯度)
5、其它:盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三***乙酸、PEG、重金属等
6、联用方法:膜过滤-盐析—等电点,离心—萃取,离心-盐析—等电点等等
第七页,共27页。
B:精制分离—色谱分离:
(A)精制过程,纯度较高
(B)方法和原理:流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快,流动相为平推流。
(1)吸附分离技术:吸附—解吸附平衡,固定相(吸附剂)—流动相(洗脱剂)分配系数不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的连续过程(固相和流动相之间连续分配的过程)
吸附剂:吸附剂的选择,表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。
吸附剂的选择:根据吸附剂性质和被分离对象的性质选择。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质,非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于解吸附,对于极性大的分离对象,选择极性小的吸附剂,反之亦然。吸附剂的选择依靠经验和多次试验。
第八页,共27页。
吸附剂的种类:羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等
柱层析:羟基磷灰石,[Ca3(PO4)3OH2],HA,酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶:含硅醇基团(-Si-OH),氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。
薄层层析:例如,硅胶薄层层析和聚酰***薄膜薄层层析
硅胶薄层层析:硅胶板,硅胶H(纯硅胶),能用腐蚀性强的显色剂;硅胶G(10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶);硅胶CMC(含羧***纤维素);硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H),
硅胶板的制备:玻璃板,硅胶制备(加溶剂碾磨),铺板,活化,活化测定(约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样,苯做展层剂,Rf大小苏丹黄>,苏丹黄Rf),—)。
分析程序:点样,展层,显色。
第九页,共27页。
TLC色素指纹图谱和灰度分析
图4TLC色素指纹图谱的图像灰度分析曲线

图3色素的TLC指纹图谱

a,,RepeatedDevelopingMethod
T1→T11
T11
T1-4
T10
T9
T8
T7
T6
T5
a
b
重复展层法:展层剂1为石油醚、正己烷、异丙醇、***和甲醇比例=8-10::::-;展层剂2为石油醚:正己烷:异丙醇:***,比例为10:::-。
重复展层法呈现的TLC指纹图谱能将CQV97菌株全色素分辨成11条不同颜色条带的色素组分,从下而上依次为黄绿色、蓝绿、深蓝绿、绿色、紫色、黄色、黄色、紫色、红色、红棕色和橙黄色
第十页,共27页。

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