文档介绍：选修3《现代生物科技专题》知识点总结
专题1 基因工程
一、概念
基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。
二、基因工程的基本工具
(一)“分子手术刀”--限制性核酸内切酶(限制酶)
1、来源种类:主要是从原核生物中分离纯化出来的,约有4000种。
2、功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列(回文序列),并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
3、切割方式及结果(教材5页图1-3):错位切---黏性末端;平切---平末端
(二)“分子缝合针”--DNA连接酶
1、来源种类:从大肠杆菌分离得到的E·coliDNA连接酶;从T4噬菌体中分离得到的T4DNA连接酶
2、功能(教材5页图1-4):将双链DN***段“缝合”起来,恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E·coliDNA只能将双链DN***段互补的黏性末端之间连接起来;而T4DNA连接酶能“缝合”两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
3、与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
(三)“分子运输车”--基因进入受体细胞的载体
1、载体具备的条件:
(1)能在受体细胞中复制并稳定保存。
(2)具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。
(3)具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(4)大小合适,以便提取和在体外进行操作
(5)具有一定的安全性,对受体细胞无毒害作用
2、最常用的载体是 质粒(教材6页图1-5),它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
3、其它载体: 噬菌体的衍生物、动植物病毒
4、在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
三、基因工程的基本操作程序
主要包括四个步骤(教材8页图1-6):目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
(一)目的基因的获取
1、目的基因:主要是编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子
2、方法:从自然界中已有的物种中分离及人工合成
(1)从基因文库(基因组文库和cDNA文库)中获取目的基因
(2)利用PCR技术扩增目的基因(教材10页图1-8)
PCR是聚合酶链式反应的缩写,由穆里斯等人发明,在PCR扩增仪中完成。
实质:是一项在生物体外复制特定DN***段的核酸合成技术。
原理:DNA双链复制
前提:一段已知目的基因的核苷酸序列,以便合成引物
条件: 模板(目的基因)、原料(脱氧核苷酸)、引物(一小段单链DNA)、热稳定DNA聚合酶、酶促反应所需离子等、温度控制
过程:第一步:(变性)加热至90~95℃DNA解链;第二步:(复性)冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;第三步:(延伸)加热至70~75℃,热稳定DNA
聚合酶从引物开始互补链的合成;第四步:多次重复。
(3)通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
3、获取目的基因的三种方法比较
(1)如果知道目的基因全序列或两端的核苷酸序列,而且基因比较大,可采用PCR技术扩增
(2)如果知道目的基因的序列,而且基因比较小,可采用化学方法人工合成
(3)如果不知道目的基因的核苷酸序列,可采用构建基因文库的方法
(二)基因表达载体的构建
:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。
:目的基因+启动子+终止子+标记基因
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端,使转录在所需要的地方停止。
(3)标记基因:是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因等。
3、构建过程
(三)将目的基因导入受体细胞
:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
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①将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法(原理:农杆菌感染双子叶植物和裸子植物,其细胞中Ti质粒上的T-DNA能够转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上
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