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微生物检验规范
1。目的
明确微生物检验方法和监控标准,规范微生物检验的各项操作,通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试,从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准,确保产品品质。
2。适用范围
公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点.
职责
品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作.
品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登记和微生物检测工作。
3。3成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作,品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作.
3。4品保微生物检验员负责出具检测报告并作出符合性判定。
3。5品保科长负责微生物检测报告的审核。
4。作业程序
4。1实验器材
、培养基和试剂
—28°C
()
15。锥形瓶300ml/500ml+硅橡胶塞
、5ml、10ml
23。
4。1。2培养基和试剂
大肠菌群培养基结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、煌绿乳糖胆盐(BGLB)
3。霉菌、酵母菌培养基虎红培养基
4.***化钠
***粉剂
微生物检验的前准备
。1检验所需器具的灭菌
。
洁净干燥的培养皿,倒放于专用培养皿铁筒内,洁净干燥的移液管,尖端
朝下,置于移液管专用的铁筒内,把铁筒放在烘箱中,于120°C干热灭菌120分钟后,调至160-180C干热灭菌120分钟后,关掉烘箱,自然冷却至60C以下,方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。
。
洁净的锥形瓶,塞上硅橡胶塞并用牛皮纸包扎好瓶口,洁净的移液管,用牛皮纸包扎完善后,置于蒸汽灭菌锅中,于121C湿热灭菌20分钟即可.
。3镊子、接种环等的火焰灭菌
接种环、镊子要在酒精灯上须灼烧过方可使用;稀释操作时试管口应在火焰上方;培养基容器口边在火焰上方。
。1。4化学灭菌(75%酒精、100x10—6C1O2)
无菌超净台,手部及不能加热灭菌的PE或塑胶制品,桌子等需用化学灭菌法;操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用100x10—6ClO2擦洗灭菌。
4。
%生理盐水的配制
称取2。25g***化钠,溶于250ml蒸馏水中,经湿热灭菌即可.
。275%酒精的配制
取375ml无水酒精,则需加水375/0。75—375=125ml
4。2。
测定项目
培养基名称
培养基量/1000ml蒸馏水
杀菌条件
菌落总数
平板计数培养基
23。5g
121Cx15分钟
大肠菌群
结晶紫中性红胆盐琼脂
41。5g
煮沸灭菌2分钟
大肠菌群
煌绿乳糖胆盐
40g
121Cx15分钟
霉菌酵母
虎红培养基
35g
121Cx20分钟
灭菌完全后的培养基置于46±1°C的水浴锅中,待培养基的温度降至46±1°C方可用.
。2。4湿热灭菌的步骤:
检查蒸压釜中有否足够的水。
检查所有载有液体瓶子的螺旋盖(或塞)是否有松动。
检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。
小心地关好杀菌釜的盖/,否则不得加压.
检查排气道或排气阀是否打开.
加热,使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。蒸汽要猛烈排放2—3min,以保证蒸压釜内冷空气全部排出。关闭通风阀或排气阀。
继续加热,至达到预定压力及温度设备和培养基将在121C下维持20min,以进行灭菌。所需压力要连续维持一定时间。
所需加热时间一过,停止加热。。当压力为零时,小心打开排气阀,待蒸气排尽后,打开蒸压釜盖,让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽,并将釜内原载有的物品充分冷却。
取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子,将这些瓶子存放在无菌室的传递箱中待之冷却备用。灭菌完成后的培养基,温度降至46±1C方可使用。所有灭菌完成后的物品,在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态.
。、后把无菌室地面及超净台打扫干净,每天用100x10-6C1O2消毒桌面、地面•每月用2%过氧乙酸熏蒸。
4。2。.
。3。3实验前,提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。关掉紫外灯后,打开无菌室和超净台通风装置,30分钟后,即可进行实验操作。
样品的抽样和判定标准
。1实验前应登记样品,给样品编号,记录检验时间、品项、规格、生产日期批号、检测项目等,并根据样品数来配制培养基.
4。
天然水的产品名,抽样量、检测项目、频率、方法、标准
产品品项
抽样频率
检验项冃
检验方法
检验标准
检验时间
细菌总数
滤膜法
<50个/100ml
550ml/l。25L
天然水
正常:1瓶/2小时/线
大肠菌群
滤膜法
不得检出
恒温室放置
天后检验
霉菌酵母
滤膜法
<20个/100ml
开(关)机:2瓶/线
细菌总数
GB-4789
<20个/ml
霉菌酵母
GB-4789
<5个/ml
备注:按抽样频率,检验方法一半采用GB—4789,一半采用滤膜法。
各监控点名,抽样量、检测项目、频率、方法、标准
线别
监控点
检验项
目
水处理
源水
菌落总数
大肠菌群
霉菌酵母
砂滤出水,碳罐出水
菌落总数
大肠菌群
霉菌酵母
精滤出水
菌落总数
大肠菌
检验方法
标准规定
检验频率
取合适的稀释倍数做滤膜法
监控项目
1次/周
取合适的稀释倍数做滤膜法
监控项目
1次/维护后
取合适的稀释倍数做
监控项目
1次/天
群
霉菌酵母
RO膜系统出水
菌落总数
大肠菌群
霉菌酵母
精滤UV后出水
菌落总数
大肠菌群
霉菌酵母
膜出水、膜产水储罐、兑制水储罐、兑制水
UV后、
菌落总数
大肠菌群
霉菌酵母
氧化塔出水、洗瓶水
菌落总数
大肠菌群
霉菌酵母
水线
灌装头(开机前)
菌落总数
霉菌酵母
灌装头
洗瓶头(开机前)
洗瓶头
封盖头
滤膜法
滤膜法
WlOcfU/lOOml
1次/维护后
0cfu/100ml
<5cfu/100ml
滤膜法
<50cfu/100ml
1次/天
0cfu/100ml
<50cfu/100ml
滤膜法
<10cfu/100ml
1次/天
0cfu/100ml
<5cfu/100ml
滤膜法
<3cfu/100ml
1次/天
0cfu/100ml
0cfu/100ml
擦拭法
<2个/每灌装头
1次/周
<5个/每灌装头
<2个/每洗瓶头
<5个/每灌装头
<5个/10cm2
盖滑槽
拨盖星轮
盖贮存槽
盖斗
盖输送带
洗瓶夹
门内壁
充填槽外壁或顶部
风送轨道
输送带(接近灌装机)
冲洗后空瓶
盖下滑道中盖
操作人员手部
操作人员衣服
<5个/10cm2
<5个/10cm2
<5个/10cm2
<5个/10cm2
<5个/10cm2
<5个/10cm2
<20个/10cm2
<20个/10cm2
<20个/10cm2
<20个/10cm2
平均<2个/瓶
平均<2个/盖
<50个/双手
<50个/10cm2
4。4微生物检测方法
。1滤膜法:适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。
4。4。1。1仪器:
冰箱:0〜4°C;恒温培养箱:36±l°C/25-28°C;恒温水浴锅:46±1°C;电子天平:;
灭菌平皿:直径60mm或90mm;膜过滤设备;滤杯;0。45pm滤膜;超净工作台;真空泵;高压灭菌锅;灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品.
。1。2试剂与培养基
平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基,0。9%生理盐水,121C灭菌20min;结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2min;75%乙醇;100ppm二氧化***.
4。:
(1)将样品摇匀,取100ml倒入膜过滤装置中,打开抽滤泵,开始抽滤,抽干滤液
后关上抽滤泵.
2)将镊子在火焰上灭菌,膜用灭菌过的镊子取下,在火焰旁正面贴于预先制备的
培养基平皿中,平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数,虎红琼脂培养基用
于培养霉菌和酵母菌,VRBA培养基用于培养大肠菌群,膜下避免出现气泡。
(3)培养
a。菌落总数:倒置于36±1°C的恒温箱中,培养48h±2h。菌落总数以实际菌数报告之,单位为cfu/100ml或cfu/ml。
b。霉菌和酵母菌:倒置于25—28C恒温箱中,3d后开始观察,共培养观察5d。菌落总数以实际菌数报告之,单位为cfu/100ml或cfu/ml。
c。大肠菌群
倒置于36±1C的恒温箱中,培养18h—24h。取出平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,.
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB肉汤管内,36±1C培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群平板计数的报告:经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以①中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每100ml样品中大肠菌群数。例:在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB