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淋巴细胞的分离
人淋巴细胞的方便来源是外周血,分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。根据不同试验有相对纯度,无论采用哪种方法,应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计,根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
外周血
红细胞
粒细胞
单个核细胞
血小板
淋巴细胞
单核细胞
~
~
Ficoll:±
密度
分类
(PBMC)
(一)Ficoll分层液法
Ficoll为合成性蔗糖聚合物的商品名,无毒,但高浓度溶液往往不等渗,且粘性高,易使细胞聚集。
组成:2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份泛影葡***生理盐水
Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞,是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
±。
别名:淋巴细胞分离液
实验方法
,稀释
(外周血:稀释液=1:2)
,沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血
(Ficoll:稀释血=1:2)
℃,1500r/min,离心30min
1500rpm,20℃,30min
PBMC
红细胞、粒细胞
稀释的血浆、血小板
Ficoll
Ficoll
。
,1800r/min离心10min,弃上清。
,1400r/min离心10min,弃上清。
,计数。
分离单个核细胞纯度为95%。
淋巴细胞约占90%~95%。
PBMC悬液主要含淋巴细胞,但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。
那么怎样获得高纯度的淋巴细胞及其亚群呢?
(三)单核细胞和粒细胞的去除
原理:单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。
优点:简便易行,对细胞损伤极少。
缺点:B细胞也有较弱的粘附能力,因此有部分B细胞丢失。
该法去除单核细胞后,大约95%的单个核细胞为淋巴细胞,活性大于95%。
❈原理:苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质,能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸,导致溶酶体内因渗透压改变而破裂,释放出的酶类物质可引起细胞溶解。
❈用该法可溶解含溶酶体的细胞,如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等,B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶,因而不受影响。
❈该法去除单核细胞后,约99%的单个核细胞为淋巴细胞,活性大于95%。