1 / 7
文档名称:

不同月龄C57BL 6J小...线粒体和NAD +水平比较 冯宝怡.pdf

格式:pdf   大小:1,550KB   页数:7页
下载后只包含 1 个 PDF 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

分享

预览

不同月龄C57BL 6J小...线粒体和NAD +水平比较 冯宝怡.pdf

上传人:刘备文库 11/25/2022 文件大小:1.51 MB

下载得到文件列表

不同月龄C57BL 6J小...线粒体和NAD +水平比较 冯宝怡.pdf

相关文档

文档介绍

文档介绍:该【不同月龄C57BL 6J小...线粒体和NAD 水平比较 冯宝怡 】是由【刘备文库】上传分享,文档一共【7】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【不同月龄C57BL 6J小...线粒体和NAD 水平比较 冯宝怡 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。网络首发时间:2022-08-1212:38:23
网络首发地址:.
上海交通大学学报(医学版)

JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCE)
论著·基础研究
不同月龄C57BL/6J小鼠耳蜗线粒体和NAD+水平比较
冯宝怡1,2,3,董庭婷4,郑晓飞1,2,3,陶永1,2,3,吴皓1,2,3
,上海200011;,上海
200092;,上海200092;,上海
200092
[摘要]目的·研究不同月龄小鼠耳蜗中线粒体及烟酰***腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD+)水平
的变化,探索年龄相关性听力下降可能的机制。方法·分别选取1月龄、4月龄、8月龄及12月龄4组C57BL/6J雄性小鼠各
10只,采用听性脑干反应(auditorybrainresponse,ABR)和畸变产物耳声发射(distortionproductotoacousticemission,
DPOAE)测定4组不同月龄小鼠听觉功能;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)比较4组不同月龄小鼠耳蜗中线粒体能量
代谢相关基因Ndufb5(NADH:ubiquinoneoxidoreductasesubunitB5)、Sdha(succinatedehydrogenasecomplexflavoprotein
subunitA)、Sdhc(succinatedehydrogenasecomplexsubunitC)和Atp5b(ATPsynthase,H+transportingmitochondrialF1
complex,betasubunit)的mRNA表达水平;通过免疫荧光染色分别观察1月龄和12月龄小鼠耳蜗毛细胞中的线粒体数量变
化;通过透射电子显微镜(电镜)观察1月龄和12月龄小鼠耳蜗中内毛细胞、外毛细胞、螺旋神经节细胞及神经纤维中的
线粒体形态结构;通过定量比色法检测并比较不同月龄小鼠耳蜗中的NAD+水平。结果·小鼠的ABR和DPOAE阈值呈现
随月龄增长而升高的趋势,~(均P<),
~(均P<)。与1月龄小鼠相比,4、8、12月龄小鼠中4
个线粒体功能相关基因(Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b)mRNA的表达水平呈现随月龄增长而下降的趋势,并在8月龄开始
与1月龄的差异有统计学意义(均P<)。免疫荧光染色结果显示12月龄小鼠耳蜗内毛细胞中的线粒体数量较1月龄明显
减少。另外透射电镜在12月龄小鼠内毛细胞、螺旋神经节细胞及神经纤维中观察到空泡样变性的线粒体以及螺旋神经节细
胞中出现较大的脂褐素。小鼠内耳NAD+水平呈现随月龄增长而下降的趋势,8月龄和12月龄小鼠NAD+水平较1月龄显著
下降(均P<)。结论·随月龄增长,C57BL/6J小鼠外周听觉关键细胞的线粒体功能下降、结构异常,耳蜗NAD+水平下
降,这与小鼠听力阈值随着月龄增长而下降的表现一致。
[关键词]年龄相关性听力下降;耳聋;线粒体;衰老;烟酰***腺嘌呤二核苷酸
[DOI].1674-[中图分类号];[文献标志码]A
ComparisonofmitochondriaandNAD+levelinthemurinecochleaeofC57BL/6J
miceatdifferentages
FENGBaoyi1,2,3,DONGTingting4,ZHENGXiaofei1,2,3,TAOYong1,2,3,WUHao1,2,3
-HeadandNeckSurgery,ShanghaiNinthPeople'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolof
Medicine,Shanghai200011,China;,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China;
,Shanghai200092,China;
People'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China
[Abstract]Objective·Toinvestigatethechangesofmitochondriaandnicotinamideadeninedinucleotide(NAD+)levelsinthe
cochleaeofC57BL/6Jmiceatdifferentages,andexplorepotentialmechanismofage-·FortyC57BL/
6Jmalemiceaged1,4,8,12months,respectively,werechosenandclassifiedinto4groupsintermsofage(n=10).Auditorybrain
response(ABR)anddistortionproductotoacousticemission(DPOAE)wereconductedtodetecttheauditoryfunctionofmiceat
[基金项目]国家自然科学基金重点项目(81730028);上海市教育委员会高峰高原学科建设计划(2019821)。
[作者简介]冯宝怡(1996—),女,硕士生;电子信箱:cathrine_******@。
[通信作者]吴皓,电子信箱:******@。
[FundingInformation]NationalNaturalScienceFoundationofChina(81730028);ShanghaiMunicipalEducationCommission—GaofengClinicalMedicine
GrantSupport(2019821).
[CorrespondingAuthor]WUHao,E-mail:******@.
(医学版),2022,42(8)
2上海交通大学学报(医学版)2022,42(8)
differentages;real-timequantitativePCR(RT-qPCR)wasappliedtocomparethemRNAexpressionlevelsofthegenesassociated
withmitochondrialenergymetabolisminthecochleaeofmiceatdifferentages,includingNdufb5(NADH:ubiquinone
oxidoreductasesubunitB5),Sdha(succinatedehydrogenasecomplexflavoproteinsubunitA),Sdhc(succinatedehydrogenase
complexsubunitC),andAtp5b(ATPsynthase,H+transportingmitochondrialF1complex,betasubunit);thechangesof
mitochondrialquantityinthecochlearhaircellsfromthemiceaged1monthand12monthswereobservedbywhole-mount
immunofluorescence;themitochondrialultrastructureinthecochlearsensoryepitheliaincludingouterandinnerhaircells,
myelinatenervefibersandspiralganglionneuronsof1-and12-month-oldmicewasobservedbytransmissionelectronmicroscope
(TEM);NAD+·TheABR
thresholdsofthe12-month-oldmiceweresignificantlyelevatedincomparisonwiththoseofthe1-month-oldmiceatthefrequency
‒(P<);andtheDPOAEthresholdsofthe12-month-oldmiceweresignificantlyelevatedincomparison
withthoseofthe1-month-‒(P<).Theexpressionlevelsofthegenesrelated
tomitochondrialfunctionsincludingNdufb5,Sdha,Sdhc,andAtp5bshowedadownwardtrendwiththeage,whichinthe8-month-
oldand12-month-oldmiceweresignificantlydifferentfromthoseinthe1-month-oldmice(P<).Immunostainingshowedthat
thenumberofmitochondriaincochlearinnerhaircellsofthe12-month-oldmicewassignificantlylowerthanthatof1-month-old
,myelinate
nervefibersandspiralganglionneuronsofthe12-month-+levelshowedadecreasingtrendwithage,declining
significantlyfrom8monthsofage,comparedwiththe1-month-oldmice(P<).Conclusion·Mitochondrialdysfunctionwith
abnormalstructureanddescendingNAD+levelsinthecochleaeisconsistentwithhearingfunctiondeteriorationinC57BL/6Jaging
mice.
[Keywords]aged-relatedhearingloss;hearingloss;mitochondria;aging;nicotinamideadeninedinucleotide(NAD+)
WHO调查显示,年龄相关性听力下降在60岁以complex,betasubunit)的表达水平及NAD+水平的变
上人群中发病率达42%,可造成严重的社会及经济负化,听性脑干反应(auditorybrainresponse,ABR)、
担[1]。年龄相关性听力下降病因复杂,其危险因素畸变产物耳声发射(distortionproductotoacoustic
包括耳蜗老化、环境因素、遗传易感性、家族史和合emission,DPOAE)的听阈改变,以及耳蜗线粒体超
并疾病等[2]。年龄相关性听力下降可伴有耳蜗感觉微结构受损的情况,探讨耳蜗线粒体能量代谢对年龄
毛细胞和螺旋神经节的丢失,以及血管纹萎缩等一系相关性听力下降发生发展的影响。
列听觉系统的退行性病变。SCHUKNECHT根据人类
内耳病理分型将年龄相关性听力下降分成4型,分别1材料与方法
是感音性、神经性、血管纹性及机械性年龄相关性听
力下降,
论。线粒体的受损、
损伤导致耳蜗老化及感觉细胞的退行性病变很可能是上海吉辉实验动物饲养有限公司,生产许可证号为
年龄相关性听力下降的原因[3]。已有研究[4]表明,SCXK(沪)2017-0012,无噪声暴露史。小鼠饲养及
线粒体在多个方面参与年龄相关性听力下降的发生发动物实验操作在上海交通大学医学院附属第九人民医
展,包括线粒体DNA突变、线粒体能量代谢异常及院动物饲养中心进行,实验动物使用许可证号为
凋亡调节异常等。而烟酰***腺嘌呤二核苷酸SYXK(沪)2020-0025。
(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD+)(#74136,
体重要的能量代谢活动及多种细胞活动,在细胞衰老德国Qiagen),反转录试剂盒、SYBRGreenPremix
中也起到重要作用[5]。本研究拟通过观察不同月龄ProTaqHSqPCRKit(艾科瑞生物工程有限公司),
C57BL/6J小鼠耳蜗中的线粒体能量代谢中氧化磷酸NAD+/NADH定量比色试剂盒(K337-100,美国
化相关基因Ndufb5(NADH:ubiquinoneBioVision)。抗小清蛋白(parvalbumin)抗体
oxidoreductasesubunitB5)、Sdha(succinate(#P3088,美国Sigma)和抗热休克蛋白60(HSP60)
dehydrogenasecomplexflavoproteinsubunitA)、Sdhc抗体(#12165,美国CST),二抗(Donkeyanti-
(succinatedehydrogenasecomplexsubunitC)和Atp5brabbitAlexaFluor488和Donkeyanti-mouseAlexa
(ATPsynthase,H+transportingmitochondrialF1Fluor594)及封片剂(美国Invitrogen),驴血清(美
JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCE)
冯宝怡,等不同月龄C57BL/6J小鼠耳蜗线粒体和NAD+水平比较3
国Abbkine)。Rpl19(ribosomalproteinL19)为内参基因进行标准
−ΔΔ
TDT听觉诱发电位工作站(TDTSystem3RZ6化,并使用2Ct方法计算出Ndufb5、Sdha、Sdhc和
workstation)、MF1扬声器(美国Tucker-DavisTech),Atp5b的相对量。
共聚焦显微镜(,德国),透射电
DMi8Leica120kV表1实时荧光定量PCR引物序列
子显微镜(透射电镜,美国赛默飞),多功能酶标仪Tab1Primersequencesforreal-timeqPCR

(瑞士Tecan)。NameSequence(5'3')
Ndufb5-ForwardCTTCGAACTTCCTGCTCCTT
-ReverseGGCCCTGAAAAGAACTACG
-ForwardGGAACACTCCAAAAACAGACCT
按月龄分为4个组:1月龄组、4月龄组、8月龄组及Sdha-ReverseCCACCACTGGGTATTGAGTAGAA
12月龄组。通过ABR和DPOAE检测小鼠听力,实时Sdhc-ForwardGCTGCGTTCTTGCTGAGACA
Sdhc-ReverseATCTCCTCCTTAGCTGTGGTT
荧光定量PCR检测小鼠线粒体功能相关基因的表达,
Atp5b-ForwardGGTTCATCCTGCCAGAGACTA
透射电镜下观察小鼠耳蜗各类细胞的超微结构,比色
Atp5b-ReverseAATCCCTCATCGAACTGGACG
试剂盒检测不同组小鼠耳蜗的NAD+/NADH水平。
Rpl19-ForwardACCTGGATGAGAAGGATGAG

Rpl19-ReverseACCTTCAGGTACAGGCTGTG
RZ6workstation对小鼠进行ABR及DPOAE检测。通
过赛拉嗪(20mg/kg)和***(100mg/kg)
腹腔注射对小鼠进行麻醉,并将小鼠放置到隔声屏蔽后取出的部分耳蜗放入4%多聚甲醛中,4℃固定过
室的恒温直流加热垫上维持体温。以小鼠左耳为测试夜,,4℃脱钙12h。在
耳对小鼠进行ABR检测:将3种电极插入小鼠皮下,解剖显微镜下进行耳蜗铺片,并将耳蜗基底膜分为
包括小鼠头顶正中(记录电极)、耳乳突区(参考电顶、中、底圈3个部分。铺片组织在室温下用含8%
极)和臀部背侧(接地电极)。%TritonX-100的PBS(10mmol/L,
给声,扬声器前端接有3cm软管,)封闭1h,然后一抗4℃孵育过夜。一抗抗
置于小鼠外耳道口,~:抗小清蛋白抗体(1∶300)和抗HSP60抗体(1∶
内共7个频率的闭合场短纯音(toneburst)刺激,声200)。%TritonX-100清洗3次,每次
音强度自90dBSPL开始,以5dBSPL为1个间隔递5min;接着二抗室温孵育1h。一抗和二抗均以8%
减;%TritonX-100稀释。PBS洗3遍后,封
值。对小鼠进行DPOAE检测:同时给予小鼠2个不片、晾干,于共聚焦显微镜镜下观察。
同频率(f/f=)的声音刺激,
12
相同,并在2f-f位置读取DPOAE振幅;检测频率置于冰上,用4%%戊二醛混合固定液
12
~,声音强度自进行耳蜗灌注,%戊二醛中4℃固定过
80dBSPL开始,以5dBSPL为1个间隔递减;以可夜。,4℃脱钙
检测到振幅的最低刺激强度确定阈值。5h;1%四氧化锇室温固定2h。
***中进行梯度脱水,然后将样
臼处死,迅速取出双侧耳蜗,将部分耳蜗组织放入预品包埋在Epon812树脂中,65℃聚合48h。将耳蜗
冷的RNA保护液中避免RNA降解。在解剖显微镜下在螺旋器水平切成薄片,切片样品用乙酸双氧铀和柠

去除前庭后液氮速冻保存于80℃。对耳蜗进行研磨檬酸铅双重染色,用120kV透射电镜观察。
后按照TRIzol法提取RNA,+水平检测使用NAD+/NADH
为cDNA。使用SYBRGreenPremixProTaqHSqPCR定量比色试剂盒检测耳蜗组织中的NAD+水平。一个
Kit进行PCR扩增,引物序列见表1,扩增程序为:样品需要2个耳蜗,每个年龄组检测4个样品,即
μ
95℃孵育5min;随后95℃10s,60℃10s,72℃8个耳蜗。将耳蜗取出后,置于400LNAD+/NADH
10s,共45个循环。将每个靶基因的相对表达量以提取缓冲液中进行匀浆,16000×g离心5min。提取
(医学版),2022,42(8)
4上海交通大学学报(医学版)2022,42(8)
上清液并分成3份,分别用于测量NADt(NAD+和2结果
NADH的总和)、NADH和蛋白质含量。NADH的测
定需要先置于60℃条件下30min,将NAD+
后进行。检测NADt和NADH的样品上清液与反应液通过TDT系统分别检测了1、4、8、12月龄
混合后,使用酶标仪检测450nm处的吸光度值4个年龄组(每组5只)C57BL/6J小鼠的ABR和
[D(450nm)];蛋白质浓度通过BCA法检测。标DPOAE阈值,结果提示小鼠听觉功能随年龄增长而
准化的NAD+水平通过以下公式计算:(NADt-下降,特别是高频听力(图1)。相较于1月龄小鼠,
NADH)/蛋白质。C57BL/~
(均P<),在8月
~
,(均P<),12月龄时全频听力下降,
定量资料用x±s表示,组间比较采用两样本t检验、阈值显著升高(均)。同样,月龄和
xABRP<
单因素方差分析或两因素方差分析。所有实验至少重12月龄C57BL/~
复3次。P<。(均P<)。
①②③④⑤
Note:=,P=,P=,P=,P=

,P=,comparedwith1month.
图1不同月龄C57BL/6J小鼠听力比较(n=5)
Fig1ComparisonofauditoryfunctioninC57BL/6Jmiceatdifferentages(n=5)
,毛细胞中HSP60表达数量减少,
逐渐下降说明内毛细胞中线粒体数量较1月龄明显减少
4组小鼠耳蜗内线粒体能量代谢中氧化磷酸化相(图2B)。
关基因Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b的表达水平见图
2A。以1月龄C57BL/6J小鼠作为对照组,分别与4、
8、12月龄组的小鼠mRNA相对表达量进行比较。结透射电镜比较1月龄和12月龄小鼠耳蜗中内外
果表明,与1月龄小鼠相比,4、8、12月龄小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞及神经纤维中的线粒体超
中Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b这4个基因的表达水微结构。可见与1月龄小鼠相比,12月龄C57BL/6J
平呈现随年龄下降的趋势,并从8月龄开始差异有统小鼠外毛细胞中的线粒体结构正常(图3),而在内
计学意义(均P<)。为进一步观察耳蜗毛细胞中毛细胞、螺旋神经节细胞及神经纤维中线粒体出现
的线粒体状态,对1月龄和12月龄小鼠的耳蜗毛细胞空泡样变性(图3),螺旋神经节细胞中线粒体体积
及线粒体进行染色和观察,HSP60抗体用于标记线粒变大,同时在胞质中可观察到较大的脂褐素形成。
体,小清蛋白抗体用于标记毛细胞,结果发现在12
JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCE)
冯宝怡,等不同月龄C57BL/6J小鼠耳蜗线粒体和NAD+水平比较5
①②③
Note:,Sdha,Sdhc,andAtp5binthecochleaeofmiceatagesof1,4,=,P=,P=,
④⑤⑥
P=,P=,P=(green)andparvalbumin(red)stainedatthemiddleturnofthecochleaeof
miceaged1monthand12months.
图2不同月龄C57BL/6J小鼠耳蜗线粒体功能相关基因和蛋白表达水平的比较
Fig2Comparisonofexpressionlevelsofmitochondrialfunction-relatedgenesandproteinsinthecochleaeofC57BL/6Jmiceatdifferent
ages
Note:Mitochondrialultrastructureinouterhaircells(OHC),innerhaircells(IHC),myelinatednervefibersandspiralganglionneurons(SGN)inthecochleae
,andthestructuresintherectanglesareenlargedanddisplayedontheright;the
arrowindicateslipofuscin.
图31月龄和12月龄C57BL/6J小鼠耳蜗中不同细胞的线粒体超微结构对比
Fig3Comparisonofmitochondrialultrastructureindifferentcellsinthecochleaeofmiceaged1monthand12months
+水平随月龄增长逐月龄小鼠相比,4、8、12月龄小鼠耳蜗NAD+水平呈
渐下降现随月龄增长而下降的趋势,并自8月龄开始与1月
4组小鼠耳蜗NAD+水平见图4。结果表明,与1龄NAD+水平相比差异有统计学意义(均P<)。
(医学版),2022,42(8)
6上海交通大学学报(医学版)2022,42(8)
ⅠⅡⅤ
呼吸链复合体、、的组成亚基,可反映线粒体氧
化磷酸化的功能[14-15]。本研究发现在C57BL/6J小鼠耳
蜗中Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b的mRNA表达水平,
随月龄增长而逐渐下降,提示耳蜗线粒体功能逐渐下降。
老年小鼠的毛细胞会随年龄增长而丢失,我们也对耳蜗
毛细胞及其线粒体进行染色观察,发现12月龄小鼠耳
蜗毛细胞中线粒体数量明显减少,提示这可能影响耳蜗
毛细胞功能。而透射电镜观察也发现在12月龄小鼠的
内毛细胞、神经纤维和螺旋神经节细胞中观察到线粒体
①②
:
NoteP=,P=,并且出现较大的脂褐素。线粒体大多数
图4不同月龄C57BL/6J小鼠耳蜗NAD+水平比较
Fig4Comparisono