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ChinaJournalofChineseMateriaMedica
ISSN1001-5302,CN11-2272/R
《中国中药杂志》网络首发论文
题目:骨康胶囊对大鼠肝细胞色素P450酶活性及蛋白表达的影响
作者:杨畅,李靖,孙佳,陆定艳,陈帅帅,李勇军,王永林,刘亭
DOI:.
收稿日期:2022-05-10
网络首发日期:2022-06-23
引用格式:杨畅,李靖,孙佳,陆定艳,陈帅帅,李勇军,王永林,
大鼠肝细胞色素P450酶活性及蛋白表达的影响[J/OL].中国中药杂志.
/
网络首发:在编辑部工作流程中,稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶
段。录用定稿指内容已经确定,且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期
刊特定版式(包括网络呈现版式)排版后的稿件,可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出
版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合《出
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辑部对刊文的录用要求,不存在学术不端行为及其他侵权行为;稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、
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为确保录用定稿网络首发的严肃性,录用定稿一经发布,不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容,
只可基于编辑规范进行少量文字的修改。
出版确认:纸质期刊编辑部通过与《中国学术期刊(光盘版)》电子杂志社有限公司签约,在《中国
学术期刊(网络版)》出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版,以单篇或整期出版形式,在印刷
出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为《中国学术期刊(网络版)》是国家新闻出
版广电总局批准的网络连续型出版物(ISSN2096-4188,CN11-6037/Z),所以签约期刊的网络版上网络首
发论文视为正式出版。
中国中药杂志
骨康胶囊对大鼠肝细胞色素P450酶活性及蛋白表达的影

杨畅1,李靖1,孙佳1,陆定艳1,2,陈帅帅1,2,李勇军2,王永林1,
刘亭1
(,贵州贵阳550004;
民族药与中药开发应用教育部工程研究中心,贵州贵阳550004)
*通信作者刘亭,博士,教授,硕士生导师,主要从事中药药理研究,Tel:(0851)86908468,E-mail:******@
摘要骨康胶囊常与药物联用治疗骨折、骨性关节炎及骨质疏松。细胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)主要
存在于肝脏中,参与多种内源和外源性物质的氧化代谢,是产生药物代谢性相互作用,导致不良反应发生的重要原
因。因此,研究骨康胶囊对CYP450活性和表达的影响,对增加其临床合理用药、提高药物联合应用的安全性具有重
大意义。该文通过Cocktail探针药物法检测高、中、低剂量骨康胶囊对大鼠肝脏CYP1A2、CYP3A2、CYP2C11、
CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1活性的变化;利用***化钙法提取大鼠肝微粒体,通过Westernblot技术检测上述6个
CYP亚型酶的蛋白表达。结果显示低剂量骨康胶囊可诱导大鼠CYP3A2、CYP2D4,中剂量骨康胶囊不对其产生影
响,高剂量骨康胶囊可抑制大鼠CYP3A2、CYP2D4;高剂量骨康胶囊不影响大鼠CYP2C11,但低、中剂量的骨康胶
囊可诱导大鼠CYP2C11;骨康胶囊可非剂量依赖性地抑制大鼠CYP2C19,诱导大鼠CYP1A2,但不影响大鼠
CYP2E1。如果骨康胶囊与CYP1A2、CYP2C19、CYP3A2、CYP2C11和CYP2D4底物共同给药,则应调整剂量,避
免药物相互作用。
关键词骨康胶囊;细胞色素P450;Cocktail探针药物法;肝微粒体;Westernblot
DOI:.
EffectsofGukangCapsulesonactivityandproteinexpressionofhepatic
cytochromeP450enzymeinrats
YANGChang1,LIJing1,SUNJia1,LUDing-yan1,2,CHENShuai-shuai1,2,LIYong-jun2,WANGYong-lin1,LIUTing1
(,GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,GuizhouMedical
University,Guiyang550004,China;
ChineseMedicine(MinistryofEducation),GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)
AbstractGukangCapsulesareoftenusedincombinationwithdrugstotreatfractures,osteoarthritis,andosteoporosis.
CytochromeP450(CYP450)mainlyexistsintheliverandparticipatesintheoxidativemetabolismofavarietyofendogenous
-,itisof
greatsignificancetostudytheeffectofGukangCapsulesontheactivityandexpressionofCYP450forincreasingitsclinical
,theCocktailprobemethodwasusedtodetect
收稿日期:2022-05-10
基金项目:国家自然科学基金项目(U1812403-05);贵州省优秀青年科技人才项目(黔科合平台人才[2021]5619号);贵州省普通高
等学校科技拔尖人才项目(黔教合KY字[2021]033);贵州省科技计划项目(黔科合J重大字[2015]2002)
作者简介:杨畅,博士,副教授,硕士生导师,主要从事民族药开发利用及药剂学研究,Tel:(0851)86908468,E-mail:
clare_******@
网络首发时间:2022-06-2316:18:55网络首发地址:.
2中国中药杂志
thechangesoftheactivitiesofCYP1A2,CYP3A2,CYP2C11,CYP2C19,CYP2D4andCYP2E1inratliveraftertreatment
withhigh,,and

low-doseGukangCapsulescouldinduceCYP3A2andCYP2D4inrats,medium-doseGukangCapsuleshadnoeffecton
them,andhigh-doseGukangCapsulescouldinhibitCYP3A2andCYP2D4inrats;high-doseGukangCapsulesdidnotaffect
CYP2C11inrats,butlowandmediumdosesofGukangCapsulescaninduceratCYP2C11;GukangCapsulescaninhibitrat
CYP2C19andinduceratCYP1A2inadose-independentmanner,-
administeredwithCYP1A2,CYP2C19,CYP3A2,CYP2C11andCYP2D4substrates,thedoseshouldbeadjustedtoavoid
druginteractions.
KeywordsGukangCapsules;CytochromeP450;Cocktailprobes;Livermicrosomes;Westernblot
骨康胶囊属于苗族骨伤科药品,主要含补骨脂、三七、续断、芭蕉根和酢浆草等,具有滋补肝
肾、强筋壮骨、通络止痛等功效,临床上多用于治疗骨折、骨性关节炎及骨质疏松,并常与阿托伐他
汀钙、阿卡波糖、硝苯地平控释片、布洛芬缓释胶囊等西药联合使用[1-2]。细胞色素P450是重要的I
相代谢酶,主要存在于肝脏内质网中,可代谢药物、毒物、类花生四烯酸等多种内、外源性化合
物[3-4]。其亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2E1等参与90%临床常用药
物的代谢[5-6],是产生药物代谢性相互作用,导致副作用发生的重要原因[7],因此研究骨康胶囊对
CYP450的影响具有重要意义。本文使用Cocktail探针药物法[8-9]评估咖啡因(CYP1A2)、睾***
(CYP3A2)、甲苯磺丁脲(CYP2C11)、奥美拉唑(CYP2C19)、美托洛尔(CYP2D4)及***唑沙宗
(CYP2E1)的药代动力学参数,研究骨康胶囊对大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP2E1、CYP2C19、
CYP2D4、CYP3A26种CYP亚型酶活性的影响,然后使用Westernblot技术检测骨康胶囊对上述6
种CYP亚型酶的蛋白表达,以期为骨康胶囊的临床合理应用提供实验依据,进一步提高骨康胶囊的
临床用药安全性和有效性。
1材料

24只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(SD,体质量200~250g),购自长沙天勤生物技术有限公
司,许可证号SCXK(湘)2014-0011,经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号1503017)。
将大鼠喂养于通风良好,光照充足,湿度40%~70%,温度20~25℃的环境中。每天更换新鲜的纯净
水并喂养标准的老鼠饲料,进行适应性饲养7d后开始实验。

骨康胶囊(贵州维康子帆药业股份有限公司,批号20180521);睾***(>98%,批号J0305A)、
奥美拉唑(>98%,批号J0508A)、甲苯磺丁脲(>98%,批号J1010A)、***唑沙宗(>98%,批号
J1115A)、酒石酸美托洛尔(美托洛尔,>98%,批号F0601A)均购自大连美仑生物技术有限公司;
咖啡因(>98%,美国Sigma公司,批号M1082);葛根素对照品(>98%,四川省维克奇生物科技有
限公司,批号wkq16080605);抗β-actin抗体(批号ab8226)、抗CYP1A2抗体(批号
ab22717)、抗CYP3A抗体(批号ab3572)、抗CYP2E1抗体(批号ab28146)、抗CYP2C19抗体
(批号ab137015)、抗CYP2C11抗体(批号ab3571)均购自英国Abcam公司;抗CYP2D抗体(美
国CST公司,批号#73867);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(批号TB260069)、辣根过氧化物
酶标记山羊抗鼠IgG(批号TC262979)均购自美国Invitrogen公司。

超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(UPLC-TQD,美国沃特世公司);PowerPacTM
Basic电泳仪(美国Bio-Rad公司);Trans-Blot®TurboTM蛋白快速转印仪(美国Bio-Rad公司);
GBOX-Chemi-(英国Syngene公司)。
杨畅等骨康胶囊对大鼠肝细胞色素P450酶活性及蛋白表达的影响3
2方法

将24只雄性SD大鼠随机分为4组,即空白组(灭菌蒸馏水)、骨康胶囊低剂量组(
g·kg-1·d-1)、骨康胶囊中剂量组(·kg-1·d-1)、骨康胶囊高剂量组(·kg-1·d-1),
每组6只,连续灌胃给药7d,每天2次。
、CYP3A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、
CYP2E1活性的影响
连续给药7d后,自由饮水禁食12h,经由大鼠尾静脉注射Cocktail探针混合药物,含咖啡因
(·kg-1)、睾***(·kg-1)、***唑沙宗(·kg-1)、奥美拉唑(·kg-1)、甲
苯磺丁脲(·kg-1)、美托洛尔(·kg-1)。用装有1%肝素钠的离心管分别于注射后
5、10、20、40min及1、、2、、3、5、10、12、,6000r·min-1
离心5min,分离100µL血浆,于-20℃冰箱中储存备用。100µµg·mL-1葛根
素溶液100µL作为内标,涡混1min,加入甲醇400µL,涡混3min,超声5min,12000r·min-1离
心10min后取上清液,于45℃氮气下浓缩。使用50%甲醇水溶液400µL将残渣复溶,12000
r·min-1离心10min,取上清液进行UPLC-MS分析,其方法的专属性、线性关系、检测限、回收率
与基质效应、精密度和稳定性已进行考察[8-9],符合后续药动学实验要求。
色谱条件:样品使用WatersACQUITYTMUPLC-
数据分析,使用WatersBEHC18色谱柱(×50mm,µm)进行分离,%的甲酸
乙***(A)-%甲酸水溶液(B),梯度洗脱条件见表1,·min-1,柱温45℃,进样
量1µL。
表1梯度洗脱条件
Table1Conditionsofgradientelution
时间/min流动相A/%流动相B/%曲率
01090—





质谱条件:通过正、负离子模式进行检测,选择单离子检测(singleionrecord,SIR)模式扫
-1
描;毛细管电压3kV;离子源温度120℃;去溶剂气温度350℃;去溶剂气N2,流速650L·h;反
-1-1
吹气N2,流速50L·h;碰撞气为氩气,·min;各探针药物及内标的质谱条件见表2。
表2Cocktail探针底物和内标的质谱条件
Table2MassspectrometryconditionsforCocktailprobesubstratesandinternalstandard
检测物电喷雾离子源母离子质荷比(m/z)锥孔电压/V
奥美拉唑+
咖啡因+
美托洛尔+
睾***+
甲苯磺丁脲–
***唑沙宗–
葛根素(IS)+
4中国中药杂志
、CYP3A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1
表达的影响
连续给药7d后,自由饮水禁食12h,股动脉放血处死大鼠,获取大鼠肝脏,使用***化钙法制备
肝微粒体,用BCA法测定蛋白质浓度。使用肝微粒体将6×蛋白buffer稀释为1×后混匀,100℃加热
变性10min,冷却至室温,于-20℃冰箱中储存备用。
Westernblot分析:取9μg蛋白,用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离,使用半干转膜系统于25V、
。转膜后用5%BSA于4℃封闭4h。封闭完毕后,加入一抗(抗CYP1A2抗体1:2
000、抗CYP3A抗体1:2000、抗CYP2C19抗体1:2000、抗CYP2C11抗体1:1500、抗CYP2D抗体
1:1000、抗CYP2E1抗体1:5000、抗β-actin抗体1:5000)于4℃孵育12h。将膜用1×TBST清洗5
次后,分别与相应的二抗(1:2000)。1×TBST洗膜5次后,加入ECLPlus化学
发光显影液显影,使用Quantityone软件进行条带灰度值分析,计算目的蛋白/内参蛋白的灰度值。

根据探针药物在不同时间点的血药浓度,通过GraphPadPrism软件作图。
件计算咖啡因、睾***、***唑沙宗、甲苯磺丁脲、奥美拉唑和美托洛尔的药代动力学参数,如血药浓度
-时间曲线下面积(AUC0-t和AUC0-∞)、半衰期(t1/2)、分布容积(V)、峰浓度(Cmax)和清除率
(CL)。,数据以mean±SD表示,通过单因素方差分析对骨康胶
囊给药组和空白组的药动学参数进行比较,当方差齐性时,使用LSD检验,当方差不齐时,使用
DunnettT3检验。P<。
3结果
、CYP3A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1活性的影响
本研究采用Cocktail探针药物法[8-9]评估咖啡因(CYP1A2)、睾***(CYP3A2)、甲苯磺丁脲
(CYP2C11)、奥美拉唑(CYP2C19)、美托洛尔(CYP2D4)及***唑沙宗(CYP2E1)的药代动力学
参数,研究骨康胶囊对大鼠CYP1A2、CYP3A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E16种
CYP亚型酶活性的影响。经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪分析,咖啡因、睾***、甲苯
磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔及***唑沙宗在不同组别中的血药浓度-时间曲线见图1,通过
、睾***、***唑沙宗、甲苯磺丁脲、奥美拉唑和美托洛尔的药代动力学参
数t1/2、Cmax、AUC、V和CL,结果见表3。
与空白组相比,在骨康胶囊低、中、、、
(P<),这表明骨康胶囊可能在体内诱导大鼠的CYP1A2活性。
骨康胶囊高剂量组中睾***Cmax、AUC0-t和AUC0-∞,与空白组相比,、、
倍(P<),分布容积V和清除率CL分别降低了59%(P<)、%(P<),骨康胶囊
低剂量组中睾***清除率CL增加了70%(P<),而骨康胶囊中剂量组中所有药动学参数无明显变
化,这些结果表明骨康胶囊对CYP3A2的影响随剂量的变化而变化,但无剂量依赖性。低剂量骨康胶
囊可诱导CYP3A2活性,高剂量骨康胶囊可抑制其活性,但中剂量骨康胶囊并不影响CYP3A2活
性。
与空白组相比,骨康胶囊低、中剂量组中甲苯磺丁脲的AUC0-%、%
(P<),AUC0-∞%、%(P<),%、%
(P<);骨康胶囊高剂量组主要药动学参数AUC0-t、AUC0-∞、CL均无显著变化。这些结果表明
不同剂量的骨康胶囊对CYP2C11的影响也有一些区别,低、中剂量骨康胶囊均诱导CYP2C11活性,
但高剂量骨康胶囊不对其活性产生影响。
与空白组相比,骨康胶囊低剂量组对奥美拉唑的药动学参数无明显影响,但中、高剂量组中奥美
拉唑AUC0-、(P<),AUC0-∞、(P<),CL分别
杨畅等骨康胶囊对大鼠肝细胞色素P450酶活性及蛋白表达的影响5
%、%(P<)。因此,奥美拉唑的药代动力学行为表明骨康胶囊可能会抑制
CYP2C19活性。
与空白组相比,骨康胶囊中剂量组美托洛尔的主要药动学参数无明显变化。骨康胶囊低剂量组
AUC0-t、AUC0-∞%、%,(P<),相反的,高剂量组
AUC0-t、AUC0-∞、(P<),%(P<)。与CYP3A2结果相
似,骨康胶囊对CYP2D4的影响随剂量的变化而变化,但无剂量依赖性。低剂量骨康胶囊可诱导
CYP2D4活性,高剂量骨康胶囊可抑制其活性,中剂量骨康胶囊并不影响CYP2D4活性。
与空白组相比,骨康胶囊各给药组***唑沙宗的药动学参数没有明显变化,这表明骨康胶囊对
CYP2E1活性没有影响。
;;;。
图1大鼠静注Cocktail探针药物后咖啡因、睾***、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔及***唑沙宗的血药浓度-时间曲线(n=6)
-timecurveofcaffeine,testosterone,tolbutamide,omeprazole,metoprololandchlorzoxazoneafterintravenous
injectionofCocktailprobesinrats(n=6)
6中国中药杂志
表3大鼠静注Cocktail探针药物后咖啡因、睾***、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔及***唑沙宗的主要药动学参数(mean±SD,n=6)
Table3Pharmacokineticparametersofcaffeine,testosterone,tolbutamide,omeprazole,metoprololandchlorzoxazoneafterintravenousinjectionof
Cocktailprobesinrats(mean±SD,n=6)
-1-1-1-1-1-1
CYPs组别t1/2/hCmax/mg·LAUC0-t/h·mg·LAUC0-∞/h·mg·LV/L·kgCL/L·h·kg
±±±±±±
±±±±±±)
CYP1A2
±)±±±±±)
±±±±±±)
±±±±±±
±±±±±±)
CYP3A2
±±±±±±
±±)±)±)±)±)
±±±±±±
±±±)±)±±)
CYP2C11
±±±)±)±±)
±±±±±±
±±±±±±
±±±±±±
CYP2C19
±±±)±)±±)
±±)±)±)±±)
±±±±±±
±±±)±)±±)
CYP2D4
±±±±±±
±)±)±)±)±±)
±±±±±±
±±±±±)±
CYP2E1
±±±±±±
±±±±±±
注:与空白组比较1)P<,2)P<。
、CYP3A2、CYP2C11、CYP2E1、CYP2C19、CYP2D4表达的影响
骨康胶囊处理SD大鼠7d后,通过Westernblot检测肝脏中CYP1A2、CYP3A2、CYP2C11、
CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1的蛋白表达情况,结果见图2。与空白组相比,骨康胶囊组的CYP1A2
和CYP3A2的蛋白表达有显著变化。CYP1A2蛋白表达在所有给药条件下均显着诱导(P<)。同
样,骨康胶囊低剂量组CYP3A2的蛋白表达明显上调(P<),但骨康胶囊