大鼠二型糖尿病造模方法.doc

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大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论
专业:药理班级:六班姓名:刘畅学号:150517
摘要:据国际糖尿病联合会(InternationalDiabetesFederation,IDF)估计,%的成年人患有糖尿病。到2035年,。在2013年,,中国的糖尿病患者人数居全球之首,。糖尿病导致约510万人死亡,平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日,中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示,我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%,%。因此,为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上,本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为:使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠,通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理,合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。
关键词:2型糖尿病,SD大鼠模型,链脲佐菌素STZ,
糖尿病(diabetes)是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征,基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等,临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症,包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变,糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病***症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。
糖尿病分为1型糖尿病(Type1diabetes)和2型糖尿病(Type2diabetes)两种,1型患者因自身免疫β细胞破坏所致,每日胰岛素分泌量非常少,空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值,表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类:体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人,糖刺激后峰值低并且延迟出现;肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人,空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人,但延迟出现,因此,表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为:遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%~95%属于2型糖尿病。
2型糖尿病,即非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin-dependentdiabetes
模型。但造模需手术且不稳定因素多。只从单一方面展现治病因素。现使用较少。
(3)、化学诱导法:此类方法操作简单,成本较低,较好控制应用较多。常见三类:①四氧嘧啶(Alloxan)和链脲佐菌素(streptozotocin,STZ):四氧嘧啶可抑制葡萄糖激酶和诱导活性氧簇,从而诱发糖尿病。STZ已不对人使用的广谱抗生素,对胰岛β细胞有高选择性毒性作用[7,8]。②烟酰***腺嘌呤二核苷酸(NAD)和小剂量STZ模型:NAD为抗氧化剂清除体内自由基作用从而而降低STZ对胰岛β细胞的细胞毒性。成年Wistar大鼠先腹腔注射NAD,15min后尾静脉注射STZ,形成血浆胰岛素水平维持在正常水平,而伴有稳定的非空腹高血糖症的2型糖尿病模型[9]。③STZ诱导糖尿病:大剂量给予STZ诱导成年大鼠1型糖尿病模型;小剂量给予STZ诱导成年大鼠2型糖尿病模型。单次较大剂量STZ(80~100mg/kg)诱导新生大鼠成年后发展为2型糖尿病。用来研究有关于β细胞的再生、β细胞功能衰减及胰岛素作用缺陷的机制[10]。
但单一化学药物通常需较大剂量,毒副作用大,容易引起动物死亡。
(4)、高糖高脂联合STZ法:高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗,之后注射低剂量STZ破坏部分胰岛β细胞功能。胰岛β细胞由于胰岛素抵抗等因素进一步损害,发展为胰岛素分泌功能失偿,出现葡萄糖耐量受损,发展为2型糖尿病[11,12]。此方法构建的模型可以较好的模拟人类II型糖尿病的特点和发展情况,并且成本较低,操作方便[12,13,14]。

诱发糖尿病的机理有种属差异,不同物种之间的诱发机理差别很大。可用做糖尿病模型的动物种类包括猴、小羊、狗、兔、大鼠、小鼠、仓鼠等,其中鼠类应用最多。除以上实验性2型糖尿病鼠类模型外,另有两大类:(1)自发性2型糖尿病模型;(2)转基因动物模型[15]。

在自然条件下或基因突变发生通过遗传育种保留的动物模型。疾病的发生、发展与人类糖尿病非常相似,应用价值高,但较少考虑环境因素,来源较少,种类有限,价格昂贵。
①ob/ob小鼠:瘦素基因缺乏,常用于减肥药和抗糖尿病药物的研究和检测。
②db/db小鼠:瘦素受体基因缺陷,发病过程与人类二型糖尿病非常相似,出生约一个月后逐渐出现肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等糖尿病症状,研究中应用较多。
③KK糖尿病小鼠:胰岛素不敏感,对葡萄糖耐量小,糖尿病发病率高,有轻度胰岛素抗性,易表现糖尿病肾病特点。特点为:轻度肥胖、高血糖症、高胰岛素抵抗
④NSY(Nagoya-shibata-yasuda)小鼠:具有年龄依赖性,糖尿病发展速度较缓慢。给予高脂食物能够加速其发生过程,且会出现胰岛素分泌不足及胰岛损伤。
⑤其他:Zucker大鼠和非肥胖自发性2型糖尿病大鼠:GK(Goto-Kakizaki)大鼠,CD(Cohendiabetic)大鼠。

已有多种转基因或基因剔除小鼠糖尿病模型。相关基因位点:胰岛素受体(insulinreceptor,IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate,IRS):IRS-1、IRS-2、胰岛素分泌相关的GLUT-2、胰岛素样生长因子-1受体、葡萄糖转运蛋白GLUT-4、过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR-γ等[1]。
二、高糖高脂饮食联合STZ法


链脲佐菌素(STZ)是从无色链霉菌提取出的广谱抗生素,可抗菌、抗肿瘤但因对胰岛β细胞具有高度选择性的杀伤毒性[6]已不使用。STZ注射后迅速作用于胰岛β细胞的特异性毒性、对机体毒性较小使其成为国内外广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂[16,17]。
STZ引起的糖尿病的机制未完全清楚,主要为DNA和线粒体破坏:①含亚硝基,可诱导一氧化氮的合成,通过一氧化氮(NO)和自由基两种途径损伤胰岛β细胞DNA,增加胰岛β细胞的氧化侵袭,诱导多聚ADP核糖基化作用,消耗β细胞内NAD+和ATP,导致β细胞大量坏死[4,5];②经葡萄糖转运体2(GLUT2)进入β细胞造成DNA烷基化损伤,诱导多聚ADP核糖基化作用[3]。③胰岛β细胞损伤后,激活自身免疫,胰岛β细胞受免疫攻击[21,8]。同一种系动物中STZ致β细胞损伤程度取决于STZ剂量,低剂量诱导大鼠胰岛素细胞(INS-1)调亡,高剂量致β细胞坏死[19]。
给药途径为:静脉注射(iv)、皮下注射(sc)、腹腔注射(ip)、心内注射(ic)等[11]。因腹腔注射操作容易、准确快速,现多采用腹腔注射法。
高脂饮食使动物肥胖,胰岛素所需量增加,β细胞因过度负荷致细胞衰退,出现高血糖、高血脂等糖尿病症状[19]。

(1)、大鼠品系、性别、年龄(体重)均有影响。
①Wistar大鼠成模率低于SD大鼠且死亡率均高于SD大鼠[20];杨亦彬等人报道:%,%,非空腹组成模率仅10%,未成模大鼠空腹下追加小剂量STZ不能成模。成模鼠肾胰显示特征性改变。不同时点血糖值差异大[21]。
②年龄影响大鼠对STZ的敏感性,现成年大鼠模型多用200~250g的大鼠制备[1]。
③雄性大鼠比雌性大鼠成模率高,稳定性好,耗时短。单纯高糖高脂饮食喂养的雄性、雌性大鼠,血糖血脂无差异,但注射STZ后,雌性鼠对STZ敏感性弱于雄性鼠,雄性大鼠血糖升高并稳定在较高水平,而雌性需要再一次注射STZ,模型才能相对稳定[1,22]。
(2)、成模后动物状态:
糖尿病SD大鼠在注射STZ后第2即逐渐出现多饮、多食、多尿和体重减轻的“三多一少”症状,且可以一直维持到实验结束。随着病程的发展,逐渐出现毛发竖立无光泽、脱毛、蜷卧拱背、活动减少、伤口易感染和白内障等表现,严重者有尾部僵硬、烂尾、趾端破溃感染[16,22]。
胰腺组织变化普通大鼠的胰腺外分泌细胞及胰岛内细胞形态正常,分界清楚。注射STZ的糖尿病大鼠,胰腺外分泌细胞充血,分界不清,明显炎性浸润,细胞核破碎、溶解;胰岛内细胞大量破裂,细胞核变形溶解,残存细胞核数量少,明显分布不均[11]。胰岛变小,密度减低,胰岛分布稀疏,胰岛细胞数量减少、肿胀,胞质着色浅,细胞核固缩[20]。
应注意,建模5个月后,大鼠会出现食欲不振、极度消瘦,精神萎靡,行动迟缓,饮水量、尿量明显增加[16]。应在适当时间遵循《关于善待实验动物的指导性意见》进行适当处理并在试验后进行***[23]。


除以上描述大鼠成模后体征状态变化,大鼠项指标也会出现变化。基本变化为:建模后约1个月,大鼠各指标异常,空腹血糖值、胰岛素含量、三酰甘油及总胆固醇呈逐渐上升趋势、胰岛素敏感指数呈逐渐下降趋势至实验结束[16]。说明模型存在胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱。
指标变化情况[22,11]:
血清中胰岛素(INS)
空腹血糖(FBG):FBG≥≥
胰岛素敏感性指数(ISI):ISI=ln[1/(FBG×INS)](HOMA法)[24]低 于正常动物(说明胰岛素抵抗)。
血浆胰岛素(FINS):升高
甘油三脂(TG、CHO):升高
胆固醇(TC):升高
游离脂肪酸(FFA):升高
低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C):升高
高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C):降低
糖化血红蛋白(HbA1c):红细胞内的血红蛋白与血糖不可逆结合产物
胰腺中胰岛素的储存量:减少,<40%[25]。
郭学军等报道,葡萄糖耐量测试(OGTT)比空腹血糖监测更有诊断意义:实验前禁食12h,用20%葡萄糖溶液(2g/kg)灌胃,于空腹、服糖后30、60和120min定时鼠尾采血测定血清葡萄糖含量[24],[20]。
血清胆碱酯酶活性低,存在肝代谢功能异常[26]。

因FBG≥,[19]。之后有学者提出FBG不够全面,建议将餐后随机血糖纳入到成模标准,随机血糖>[27]。造模组中以FPG>7mmol/L作为成模标准的成模率比以随机血糖>[28]。
因此符合①体征如上文描述伴且有“三多一少”症状;②,;③胰岛素敏感指数显著低于正常大鼠或单高糖高脂喂养大鼠的对照组(P≤),也显著低于自身注射STZ前的水平,明模型组大鼠已产生胰岛素抵抗。并且各指标稳定2周以上者则说明成功诱导糖尿病模型[28,25,29]。大鼠在造模后48h时体重较造模前明显减少的特点,可以在尾静脉采血测血糖前大略估计成模率[30]。
2型糖尿病动物模型在STZ注射后的7天后到实验结束或给予治疗药物之前,FB***平一直很高,且维持稳定;同时,ISI仍明显低于正常对照大鼠(存在胰岛素抵抗)。并始终有三多一少特点,可以认为2该模型长期稳定[24,18]。


①成模后因注意将疑似1型的大鼠尽量排除出组。
1型糖尿病模型组一次成膜,血糖升高效果一直非常稳定,维持到实验结束,而且在实验过程中出现明显高血糖损害症状,如眼部损害(眼底出血、失明),坏尾及死亡等;2型糖尿病模型组则需两次甚至三次给药,同时其血糖在第一次给药后有所恢复,再次给药才逐渐稳定。2型糖尿病主要病变是胰岛素抵抗,胰岛病理改变大都较轻,血浆胰岛素水平有双向变化,即有时增高或分泌延时,高血糖及低血糖可交替出现[31],从而血糖也一直低于1型糖尿病模型[26]。
②STZ对大鼠体重有较大影响。注射STZ2后,模型大鼠体重会出现下降,小剂量STZ注射后大鼠胰腺β细胞破坏,迅速出现高血糖、多尿等代谢紊乱症状,致使体重下降[22,19]。并且,饲料中油脂含量过高加上大鼠分泌的胆汁不足以把大量的油脂转化吸收,使TG低于正常大鼠[19]。
③2型糖尿病具有的胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍两要素,按表现先后和轻重可将病程分为三期:一期,有胰岛素抵抗和高胰岛素血症,血浆葡萄糖得以维持正常;二期,胰岛素抵抗加重,虽有高胰岛素血症,但胰岛素愈高,受体愈不敏感,虽有高胰岛素血症,仍出现餐后高血糖症;三期,胰岛素抵抗仍存在,但胰岛素分泌降低,导致空腹高血糖症。胰岛分泌功能会随持久的高血糖毒性作用进一步恶化。通过此标准可划分模型所处的病程[3]。
④肥胖是一种典型的环境因素与遗传因素相互作用导致能量摄入与消耗失衡所造成的慢性疾病。在同样的饮食条件下,有些人容易发展成为肥胖,而有些人则仍能维持正常体质量。高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素方法中,高脂饮食仅能诱发一部分大鼠发生胰岛素抵抗和肥胖,另一部分则不发生胰岛素抵抗和肥胖[28]。在注射小剂量链脲佐菌素前,食源性肥胖性大鼠血糖虽无明显升高,但体质量、血脂和血清胰岛素浓度显著上升,胰岛素敏感性显著下降,即产生胰岛素抵抗[28]。
张松筠等报道:实验中50只高脂饮食大鼠仅24只出现明显的摄食增加,变的肥胖,同时伴有高胰岛素血症和胰岛素抵抗纳入食源性肥胖组,其余26只无明显体质量增加和胰岛素抵抗。虽然SD大鼠对食物营养成份敏感,但存在一定易感性差异,因此,仍有一部分大鼠的摄食量明显低于食源性肥胖大鼠,维持正常体质量,具有肥胖抵抗的特性[21]。这类大鼠成模率较低即使最终成模,也更加类似1型糖尿病。因此,建议先筛选食源性肥胖大鼠作为2型糖尿病造模对象。但由于两种大鼠几乎各占一半且筛选时间过长导致造模费用过高并用时过长[28]。
⑤2型糖尿病的形成与环境因素造成的氧化应激、自由基防御机能紊乱密切相关。放射线对细胞的生物化学损伤主要是电离辐射导致多种自由基对细胞的功能和结构损伤。一些患者的血糖空腹期<,餐后2小
时<,口服糖耐量试验(OGTT)结果介乎糖尿病与正常界限之间,称之为葡萄糖耐量减退(impairedglucosetolerance,IGT)。表现为:血糖偏高,但未达糖尿病标准。这类患者如不及时干预约有约三分之二可转变为糖尿病[3]。IGT胰岛素抵抗和氧化应激引起2型糖尿病的发生发展[3]。奚苗苗等将高脂高糖、缺失抗氧化剂和辐射产生的氧化损伤与链脲佐菌素[streptozocinSTZ]促进超氧自由基形成的自由基毒性相结合。辐射对大鼠造成了明显的自由基损伤,照射组中的氧化损伤指标如:丙二醛(MDA)、晚期糖基化终末产物(AGEs)含量升高,超氧自由基的清除剂(SOD)的活性下降。氧化应激诱发胰岛素抵抗,胰腺必需分泌足够高的胰岛素来克服胰岛素抵抗,长期的高胰岛素分泌,导致IGT的发生,IGT造成的血液黏度升高、微血管灌注不良进一步促进自由基的形成,加重了氧化损伤程度[25-10]。升高的血糖水平加之机体的氧化应激环境,能够加速AGEs的生成,2型糖尿病患者的血管病变进展迅速与AGEs影响血管壁的自稳态有关[25,32]。从而,提出在糖高脂饮食联合小剂量STZ造模时辅以抗氧化剂的去除,可以使模型对葡萄糖刺激的反应更接近2型糖尿病患者胰岛素分泌的两相性特点,同时胰腺中胰岛素也有一定的贮存量[25]。

在国内外报道中STZ在25mg/kg到45mg/kg的小、中剂量之间成模效果较好。成模大鼠均具有多饮、多食、多尿、体质量减轻等表现。胰腺破坏超过40%时,才会出现高血糖症,而大鼠之间存在个体差异,所以,同样低剂量STZ注射,可表现出不同程度的高血糖症[18]。
其中,单词注射STZ剂量在25mg/kg至35mg/kg之间长期稳定性较差且成模率较低,但对大鼠毒性伤害较小,单词注射STZ剂量在35mg/kg至45mg/kgSTZ之间,成模率高于25mg/kg至35mg/kg之间,且死亡率低于剂量达到50mg/kg的模型,血糖能维持在较高水平且稳定性较好[11],糖耐量异常和空腹糖耐量受损情况的指标较稳定[19]。也有研究人员使用两次小剂量注射STZ建立成模率较高、稳定性较好且死亡率较小的2型糖尿病模型[33,20]。
胰岛中β细胞的损伤激活了胰腺导管中的干细胞,从而影响实验动物成模的稳定性,小剂量连续应用链脲佐菌素可以克服胰岛β细胞代偿性增殖的影响,同时,实验动物成模后应继续予以高糖高脂饲料喂养,可以使血糖逐渐升高,长期高糖血症的糖毒性会损害胰岛β细胞,导致INS分泌下降,达到维持2型糖尿病动物模型稳定的效果[34]。
多次小剂量给予STZ不会造成胰腺胰岛素水平的急剧下降,大鼠胰腺中胰岛素的量可以维持在略小于40%处,胰腺保留一定分泌胰岛素的功能,这一点与2型糖尿病患者的临床症状相似
[25]。这种2型糖尿病大鼠模型的特点为:①链脲佐菌素的剂量很低,不会引起胰岛B细胞严重破坏和其它脏器的损坏(小剂量链脲佐菌素引发凋亡,大剂量链脲佐菌素则引起胰岛B细胞坏死)[28,35]②血糖持续升高,提示该模型稳定和有效。③成功模拟了2型糖尿病的自然发病过程,在长期胰岛素抵抗之后胰岛B细胞失代偿性功受损,胰岛素分泌减少。[28]。

造模后大鼠体质较差,死亡率很高,常常会影响实验结果。糖尿病是一种慢性炎性反应疾病,其固有免疫炎症细胞的功能障碍涉及全身各个系统[36,37]创面愈合过程中巨噬细胞早期进入创面的数量减少,而晚期则持续停留于创面,同时伴随着生长因子表达量的下降和相关炎症因子表达量的改变,从而导致创面愈合困难。表现为M1型巨噬细胞的数量和比例增高[21],且其分泌的炎症因子水平上升,但其刺激活化后的炎症因子表达能力和吞噬能力却明显减弱[6,22,27]。刘宸等人实验显示:糖尿病大鼠创面中的巨噬细胞早期浸润数量较低与创面愈合率具有正相关性,而晚期残留巨噬细胞数量较多且与创面愈合率具有负相关性。糖尿病状态下的巨噬细胞吞噬速度较正常慢5倍以上[30],可能导致创面坏死组织及调往细胞清除较慢持续趋化巨噬细胞浸润,同时已趋化至创面的巨噬细胞也无法顺利完成凋亡过程,并且由于炎症因子的分泌功能下降,糖尿病创面不能形成有效的负反馈机制抑制炎症反应,最终导致了愈合后期创面巨噬细胞的浸润增多、炎症反应增强。而愈合晚期增强的炎症反应不利于创面的愈合,可以导致创面上皮化的失败和血管化的困难,因此,尾静脉采血法测量血糖时,要注意采血部位的局部消毒[36]。
建立2型糖尿病SD大鼠模型应注意方面:①STZ要求保存在-20℃冰箱中,其水溶液极其不稳定使用时,现用现配,,配好后在10min内用完,注意低温、避光放置[30,38];②用来造模的大鼠应有良好的营养状态及较强的抵抗力,体重应在190g-230g之间为佳;③动物饲养密度不宜过大(小于5只/笼)④注射STZ前大鼠应空腹12h以上;⑤造模成功后大鼠尿量明显增加,故每天应换2~3次垫料,以保持鼠笼清洁,干爽;⑥造模后大鼠抵抗力较差,易发生肺炎等疾病,实验室应保持适宜、恒定的温度和湿度,并保持良好通风;⑦造模后大鼠需多次测量血糖,推荐采取尾静脉采血法,因眼眶静脉丛采血或断尾法取血法对大鼠损害较大(且断尾过于残忍已不采用),易合并感染,故要特别注意采血部位的消毒,避免感染[30]。