文档介绍：该【《大肠癌干细胞样细胞转移相关基因 】是由【陶小豆】上传分享，文档一共【13】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【《大肠癌干细胞样细胞转移相关基因 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
的挑选及克隆剖析》项目总结报告
浙江大学医学院隶属二院朱永良
一、项目研究背景
大肠癌是我国常有的发病率呈显然上涨趋向的恶性肿瘤之一。在我国大肠癌
是第4位肿瘤死亡病因。浸润转移是大肠癌主要的恶性生物学行为和治疗失败的
原由。说明大肠癌的浸润转移和复发体制是进行有效治疗的基础,对提升大肠癌
患者的生计限期和生活质量有重要意义。
大肠癌的发生发源于大肠干细胞,是大肠干细胞的疾病。遗传性和发散性大
肠癌均根源于正常大肠干细胞的突变,大肠干细胞是突变的标靶。当大肠干细胞
突变积累至必定阶段即转变为大肠癌干细胞,启动癌变过程,其实不停出现异样分
化。在大肠癌组织中存在很少许的大肠癌干细胞、大批有限增殖能力的临时放大
和终末分化癌细胞。临时放大或终末分化癌细胞群,细胞已出现分化,体内增殖
不活跃。大肠癌干细胞在大肠癌中充任干细胞角色,拥有无穷的自我更新能力和
多种分化潜能。大肠癌的浸润转移包含癌细胞侵袭和损坏其四周正常组织、降解
四周基底膜,侵入淋巴道/血道,经转运在靶组织器官逗留,定植生长等过程。
在此过程中其实不是每一个肿瘤细胞都能成功的进行转移,只有很少量拥有高度转
移潜能和增殖活性并在侵袭过程中逃逸各样杀伤要素,适应并协调继发生长的大
肠癌“种子”细胞才能在靶组织器官增殖形成转移灶。那些拥有高度转移潜能和增
殖活性的“种子”可能就是肿瘤干细胞。只管当前我们对大肠癌干细胞的生物学特
性还缺乏认识,但最近几年的研究提示大肠癌恶性生物学行为如浸润、转移和复发与
大肠癌干细胞潜能亲密有关。我们在先前以自行成立的拥有干细胞特点的条件永
生化大肠干(crypt)细胞为实验靶点,研究大肠癌癌变过程中的分子改变事件。发
现条件长生化大肠干(crypt)细胞经分别/组合的不一样致/促癌剂攻击后出现的转变
细胞接种裸鼠2月后,可在裸鼠肝脏均出现宽泛转移。提示转变大肠干(crypt)
细胞拥有侵袭力。但对大肠癌干细胞的基因表达特点,此中有哪些基因参加了其
浸润转移体制当前尚不了然。研究大肠癌干细胞生物学行为改变以及与其转移相
关的重点功能靶蛋白是大肠癌靶向治疗的基础,也是治疗的靶向特异性所在。
二、研究目标
用判定的大肠癌干细胞分选标记从人大肠癌组织中分别肿瘤干细胞,用先前构
建的大肠干(crypt)细胞全基因cDNA/pEYK3重组逆转录病毒文库技术,联合体
外细胞侵袭试验,以Akt、MAPK、FAK、Wnt、Notch和Hedgehog信号通路为
主要研究对象,挑选和判定与大肠癌干细胞转移潜能有关的重点功能靶蛋白及其
调控分子。
三、项目研究技术路线
1)DeltapLXSN逆转录病毒克隆载体建立。用高保真PCR和定点突变技术改建
pLXSN逆转录病毒载体(deltapLXSN),使之多克隆位点包含polyT,能够进
行T/A克隆。
2)大肠癌干细胞样细胞分别。从头鲜大肠癌组织顶用FCM分选出肿瘤干细胞
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
样细胞和一般肿瘤细胞。
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
3)大肠癌转移有关候选基因挑选。大肠癌干细胞样细胞和肿瘤转移组织总RNA
经逆转录、合成双链cDNA,克隆至deltapLXSN逆转录病毒载体,成立人
大肠癌干细胞样细胞cDNA逆转录病毒文库,感染正常大肠干细胞系、一般
大肠癌细胞系和用FCM去边沿细胞的体外培育大肠癌细胞系,分别接种
NOD/SCID裸鼠盲肠,成立NOD/SCID鼠肿瘤转移模型。回收转移肿瘤组
织中包含的大肠癌干细胞样细胞有关cDNA,成立大肠癌干细胞样细胞转移
有关cDNA逆转录病毒亚文库,再进行上述流程重复。最后,用PCR技术从
经3-4轮重复后的转移肿瘤组织中扩增与大肠癌干细胞样细胞转移有关的、拥有生物学活性的候选基因,DNA测序。
4)大肠癌转移有关候选基因考证。将上述挑选出的肿瘤转移有关候选基因分别
用免疫组织化学法和Real-timePCR/Northern原位杂交技术在人正常大肠组
织、癌旁组织、癌组织、转移淋奉承、肝组织和大肠癌高、低转移细胞株中
进行考证。
四、项目研究内容
在本研究中我们第一采纳在引物5’端加入polyA的方法,分别对野生型
pLXSN、pLPCX、pLNCX逆转录病毒载体进行了改建。以pLXSN、pLPCX、pLNCX
质粒为模板,用高保真、长序列PCR进行了扩增,经电泳纯化和复性后获取了
多克隆位点包含polyA的pLXSN逆转录病毒载体,使之能够进行T/A克隆。
其次,我们成立了大肠癌干细胞样细胞的分选流程。因为CD133已被明确是大
肠(癌)干细胞的特点性标记,考虑到从原代组织中分别大肠癌干细胞方法的适用
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
性。因此我们成立了用免疫磁珠技术从原代组织中分别大肠癌干细胞的方法,方
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
法原理见图1。我们先将原代组织漂洗除菌,而后用胶原酶/透明质酸酶将原代组
织消化成单个细胞,加入鼠抗人CD133抗体,反响后离心清洗2次,加入羊抗
鼠IgG磁珠,反响后放入磁场,分别出大肠癌干细胞和一般大肠癌细胞。进一步商讨了原代大肠癌干细胞的体外培育条件。发现无血清培育液和鼠成纤维细胞
MEF可支持大肠癌干细胞生长(图2)。
为剖析大肠癌干细胞样细胞参加大肠癌转移有关候选基因挑选。我们对大肠
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
癌干细胞样细胞和肿瘤转移组织总
经逆转录、合成双链
cDNA,克隆至
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
pLXSN
逆转录病毒载体,成立人大肠癌干细胞样细胞
cDNA
逆转录病毒文库,
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
感染正常大肠干细胞系、一般大肠癌细胞系和去边沿细胞的体外培育大
肠癌细胞系,分别接种裸鼠的方法挑选转移有关候选基
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
因。最后,用PCR、(Affymetrix)基因表达差别谱芯片的
方法我们从大肠癌干细胞样细胞中挑选到了包含NADE3(即hBex1,挑选编号:
Rex3)、pcdh10、HDGF、pcdh23、Reelin、JKK等约30个功能基因在大肠癌干细
胞样细胞中出现了改变(图3)。只管这些基因在正常大肠组织、癌旁组织、癌组织、
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
abc
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
(a)和一般大肠癌细胞(b)基因表达差别谱扫描和聚类剖析(c)
转移淋奉承、肝组织和大肠癌高、低转移细胞株中出现了相应的改变,可是从头
表达这些基因又对细胞产生何种影响呢?因此我们在这儿选择了最具明显下调
的NADE3进行了研究,发此刻大肠癌干细胞样细胞中NADE3表达下调近千倍,
克制其启动子***化尚不可以恢复其表达,Westernblot检测也显示了相应的改变
(图4)。从SW1116大肠癌细胞系中克隆了其全长cDNA序列并克隆到了
pEGFP-c1真核细胞表达载体,成立了稳固表达NADE3的发现SW1116大肠癌细
胞系,发现NADE3蛋白表达以胞浆为主,少许出此刻胞核中,提示NADE3蛋
白可在胞浆和胞核出现穿越,但其穿越分子体制有待于进一步研究。
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
从头表达NADE3对细胞功能产生何种影响呢?我们用蛋白芯片检测比较了
表达NADE3细胞和比较空载体细胞在细胞信息通路中的改变状况(图5)。结果
发现从头表达NADE3激活了Mek1/2和JKK。提示NADE3可能经过CDC42/Rac
激活RhoA通路(图6)。但是,NADE3其实不可以被CDC42/Rac抗体免疫共积淀,
提示在NADE3和CDC42/Rac之间存在其余的功能分子,进一步我们再次用
(Affymetrix)基因表达差别谱芯片比较检测了NADE3缄默和从头表
达细胞间出现的基因表达改变,发现先前挑选到的pcdh10,而不是pcdh23在
NADE3从头表达细胞出现了一致的改变。提示NADE3(Rex3)和PCDH10之间存
在下班、互相作用。此外发现从头表达NADE3可促使细胞在无血清下的增殖,
可能可影响p27kip蛋白在胞浆、核的定位和提升对化疗药物顺铂的凋亡敏感性
(图7)。PCDH10是属于Ca2+依靠性钙粘蛋白超家族的一员,拥有6个重复串连
的胞外区和1个独到的胞内区。在对原代肿瘤干细胞基因表达谱时用病毒文库技
术挑选时发现pcdh10-/-细胞易游出和穿过“Transwell”的半透膜,而pcdh10+/+的细
胞迁徙性较弱。经过生物信息学剖析,进一步克隆了pcdh10的全长cDNA序列
并建立了表达pcdh10的真核细胞表达载体,经过脂质体刹时转染K562细胞、
SW480大肠癌细胞发现异位表达PCDH10克制了这些细胞在体外的增殖,并增
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
加了细胞的凋亡。进一步发现对这些细胞进行无血清饥饿和增添化疗药物等办理
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
后PCDH10表达水平随时间和浓度的增添而增添,提示PCDH10参加了细胞凋
亡,可能是一个肿瘤克制基因。然对其参加细胞凋亡的分子体制尚不了然。为探
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
讨PCDH10在大肠癌组织中的表达改变,我们用
1种针对
PCDH10
胞外区的单
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
抗和多抗时发现
PCDH10
在大肠癌组织中并没有显然的改变。而用针对
C尾端的
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
引物进行PCR扩增时发此刻大肠癌干细胞样细胞中出现了明显的转录下调,表
明PCDH10在大肠癌细胞中出现了剪拼改变,PCDH10C端蛋白分子片段可能链
接了1个独到的细胞信息转导通路,因次我们制备了一种针对PCDH10C端蛋白
分子片段的特异性抗体,为进一步研究该蛋白功能打下了基础。
hBex1(NADE3)
Control
图5.
蛋白芯片检测比较从头表达
NADE3对细胞信息通路影响
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
a
b
c
图7.
表达NADE3促使细胞在无血清下的增殖
(a),和影响p27kip蛋白在胞浆、核的
定位(b)及提升对化疗药物顺铂的凋亡敏感性
(c)
五、项目研究成就
本项目研究大肠癌干细胞样细胞中出现NADE3、pcdh10、HDGF、pcdh23、
Reelin、JKK等约30个功能基因改变,初次发现了PCDH10C端蛋白分子片段可能
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
链接了1个独到的细胞信息转导通路;获取了1个一种针对PCDH10C端蛋白片段
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因
《大肠癌干细胞样细胞转移有关基因